Ezio Auditorul de la Firenze, de 40 de ani, sa urcat la vârful ierarhiei ordinului după încheierea evenimentelor jocului Assassin's Creed II. După răzbunarea ucigașilor tatălui și fraților săi, el a părăsit Roma și sa bucurat de viață în vila lui. Jocul începe în 1499, când Ezio, după o conversație cu Minerva, a fugit din Roma cu unchiul său Mario Auditor. Apoi, orașul toscane, unde se afla Villa Auditorè - Monteriggioni (Monteriggioni) este asediat de o armată uriașă a statelor papale, întărită de trupele franceze. Fiul este înhățat de Rodrigo - Cesare Borgia. Armele lui Borgia distrug orașul, iar Cesare, în fața lui Ezio, omoară pe unchiul Mario. După escortarea locuitorilor supraviețuitori din Monteriggioni prin catacombe, Ezio decide să se răzbune pe Cesare și se duce la Roma. Pe drum, Ezio își pierde conștiința, pentru că în timpul bătăliei a fost împușcat prin umăr.
joc de acțiune este transferat la 1500, în cazul în care Ezio este obligat să organizeze și să înceapă să se dezvolte „subteran“ (care include hoții romane, mercenari, curtezane, și apoi și recruți, Assassins), atunci când începe să reînvie Ordinul, al cărui lider a fost în mod oficial Niccolo Machiavelli, care, după dă titlul de Ezio. De-a lungul jocului, Ezio încearcă să găsească pe asasinii rudelor lor, și să se răzbune pe ele, precum și revenirea la Roma a fost pace, ordine și prosperitate.
În viitor, Desmond, Lucy, Sean și Rebecca ajung în Monteriggioni. Aranjează un adăpost în Sanctuar, sub Villa Auditor, astfel încât templierii să nu le poată găsi și continuă să caute Apple de Eden pentru a opri catastrofa iminentă.
se Ezio cu ajutorul lui Bartolomeo, La Volpe și Claudia constată că Apple a Edenului a fost repartizat pentru a studia omul de știință, Caterina Sforza se află în Castel Sant'Angelo în săptămâna viitoare, iar Cesare în castel cu Papa. În plus, La Volpe raportează că Machiavelli este un trădător și chiar își arată întâlnirea cu soldații lui Borgia. Dar, încrezându-se pe Machiavelli, Ezio îi cere lui La Volpe să nu facă concluzii grabe. După ce Ezio intră în castel și îl salvează pe Catherine, dar nu reușește să ajungă la Cesare. În cele din urmă, Ezio decide să recreeze Brotherhood Assassin. În aceeași seară cu Ezio, Leonardo da Vinci se întâlnește, după care Leonardo re-creează armele pierdute de Ezio. Sa dovedit că oamenii de știință cărora li sa dat mărul erau Leonardo însuși, dar Rodrigo la luat. Da Vinci raportează, de asemenea, despre toate planurile și clădirile sale pentru armata lui Cesare, pe care Ezio va trebui să o distrugă.
Cu ajutorul unui senator care vizitează bordelul Mariei, Ezio descoperă unde este Cardinalul Juan Borgia, el este și un bancher. Cu moartea lui, Cesare a pierdut bani pentru război. Apoi, Ezio și Bartolomeo intră în tabăra francezilor și o ucid pe Baron De Valois. În cele din urmă, Ezio salvează viața actorului Pietro, care în secret de la Cesare îl întâlnește pe Lucretia. Află Cesare comandat Mikiletto-l otrăvească, Ezio neutralizeaza Mikiletto, dar nu-l ucide și de a salva actorul, și în schimb primește o cheie de la ușa din spate în Castel Sant'Angelo. În aceeași seară, Ezio întâlnește un hoț cu un bandaj pe ochiul drept, cel care a participat la bătălia de la Monteriggioni. Se pare că trădătorul este el, nu Machiavelli. Ezio-l omoare pe trădător și găsește La Volpe, care a fost aproape de gând să-l omoare Machiavelli, și raportează că a învățat, lăsând o scrisoare, pe care a luat de la un hoț.
Odată ajuns în castel, Ezio decide să-l omoare Cesare, dar a aflat că Rodrigo a vrut să-l otrăvească, și îl omoară prin tortură învață locația Apple de Lucretia. Lucreția, care dorește să se răzbune pe Cesare, îi spune lui Ezio unde Yabloko. Ezio este înaintea lui Cesare, iar găsirea lui Yabloko, decide o dată pentru totdeauna pentru a termina cu Cesare. În primul rând, el distruge toate trupele lui Cesare în Roma, apoi frustrând întâlnire Cesare cu Cardinalii, așa că nu le cere ajutor. În cele din urmă, după un an Ezio permanent scapa de Cezar, când a fost arestat soldații sub acuzația de trădare și crimă.