Knockout mouse-ul - un șoarece modificat genetic în care expresia unuia sau mai multor gene este oprită folosind gena knockout. Șoarecii cu șoareci sunt modele importante pentru studiul genelor animale care au fost secvențiate, dar ale căror funcții sunt necunoscute. Prin inactivarea unei gene specifice la un șoarece și examinarea modificărilor în fenotipul său (comportament, aspect), cercetătorii pot desena deseori concluzii cu privire la funcția acestei gene.
Șoarecii sunt cei mai apropiați de organismul modelului uman la care se poate aplica această tehnică de cercetare, chiar și pentru șobolanii de aplicare este mult mai dificilă. Prin urmare, șoarecii sunt utilizați pe scară largă în studii referitoare la fiziologia umană.
utilizarea
Oprirea genei ajută cercetătorii să obțină informații despre funcția sa. Deoarece multe gene pentru soareci și oameni sunt comune, cercetarea funcției lor la șoareci permite să se obțină date despre ceea ce (sau o genă similară) corespunde corpului uman. În special, este foarte importantă în identificarea genelor responsabile de bolile umane. Exemple de studii în care pot fi utilizate șoarecii knockout sunt studiul și modelarea diferitelor tipuri de cancer, obezitate, boli de inimă, diabet, artrită, îmbătrânire și boala Parkinson. Cu ajutorul șoarecilor knock-out, puteți examina medicamentele și diferitele tipuri de terapii. Milioane de șoareci knock-out sunt folosiți în fiecare an în diferite experimente.
Există câteva mii de linii de șoareci knock-out. Multe modele de șoarece sunt denumite pentru o genă care este inactivată. De exemplu, șoarecii cu p53 knock-out sunt numiți pentru gena p53, care codifică o proteină, una dintre cele mai importante funcții fiind suprimarea creșterii tumorale datorită încetării diviziunii celulare. Persoanele născute cu mutații ale genei p53, care suferă de sindromul Li-Fraumeni, în același timp probabilitatea de a dezvolta cancer osoase, sânge și de sân la o vârstă fragedă este în creștere catastrofală.
Există unele variații în procedurile de obținere a șoarecilor knock-out, dar mai jos este o schemă generală simplificată.
- Gena care dorește să fie eliminată este izolată din biblioteca genei mouse-ului. Secvența ADN este apoi modificată pentru a face gena să nu funcționeze. De obicei, în noua secvență, ar trebui să existe și o genă marker care nu este prezentă la șoarecii normali și este responsabilă pentru rezistența la antibiotic, agent toxic sau oferă un fel de schimbare vizuală (culoare, fluorescență).
- Celulele embrionare sunt izolate din blastociste murine și crescute in vitro. În acest exemplu, celulele blastocist sunt luate de la un șoarece alb.
- O nouă secvență dintr-o etapă este transferată la celulele blastociste prin electroporare. Cu ajutorul recombinării omoloage naturale, inserarea unei noi secvențe cu o genă knock-out în locul unei gene normale va avea loc în unele celule embrionare. Șansele de recombinare reușită sunt relativ scăzute, astfel încât majoritatea celulelor au o nouă secvență numai în unul dintre cele două cromozomi - vor fi heterozigote.
- Celulele embrionare care poartă o genă knock-out sunt izolate folosind o gena marker (vezi etapa 1). De exemplu, celulele fără inserție nu vor supraviețui sub acțiunea unui agent toxic, la care knockouts rezistente asupra genei investigate sunt celule.
- Celulele stem bătut din etapa 4 sunt implantate în blastociste murine (în acest caz, cu un șoarece de culoare gri). Acum blastocistele conțin două tipuri de celule stem: tip sălbatic (cu șoareci cenușii) și celule knockout (cu șoareci albi). Aceste blastociste sunt apoi implantate în uterul mamei adoptive. Unele părți din corpul de șoareci nou-născuți vor proveni din celule de tip sălbatic, iar unele dintre celulele knockout, astfel de șoareci se numesc capricios și au o culoare gri-albă. Dacă traversați șoarecii bizarali unul cu altul, o parte din descendenți vor fi albi și vor fi homozigoți pentru genomul knock-out.
restricţii
Deși knockout-ul de gene la șoareci este un instrument extrem de puternic pentru cercetare, există limite semnificative în utilizarea sa. Aproximativ 15 la suta din knockout-ul genei este letal in timpul dezvoltarii embrionare. Această problemă poate fi evitată prin obținerea de șoareci convențional knock-out.
Când se elimină genele, șoarecii sunt uneori dificili să se diferențieze clar de fenotipul de tip sălbatic. Uneori, există și probleme cu compararea inactivării unei gene în corpul uman și pe șoarece. De exemplu, mutația genei p53, care la jumătate din cancerele umane conduce la dezvoltarea de tumori în anumite țesuturi. La șoarecii cu p53 knock-out, cancerul se dezvoltă într-un set complet diferit de țesuturi decât în mutațiile menționate mai sus la om.
