IV. Transducția semnalului de insulină
1. Semnalul de insulină este transmis celulei prin intermediul receptorului de insulină membranară
receptorilor de insulina (RI) este o protein tirozin kinaza, adică protein kinaza, proteine de fosforilare de către gruparea OH a resturilor de tirozină. Această glicoproteină construită din două subunități a (130 kD) și două subunități b (95 kDa); primul situat în întregime în afara celulei, pe suprafața sa, a doua permeat membrana plasmatică:
Structura receptorului de insulină
Centrul de legare a insulinei formează domenii N-terminale ale subunităților a. Centrul cataric de Tyr-protein kinază este localizat pe domenii intracelulare ale subunităților b. În absența insulinei, IR nu prezintă activitate tirozin kinazică. Adăugarea de insulină la situsul de legare pe subunitățile a activează enzima, substratul însuși servind ca substrat; se produce autofosforilarea: subunitățile b ale RI sunt fosforilate prin câteva resturi de tirozină.
Subunitatea catalitică RI (b subunitatea) care posedă activitate de tirozin-protein kinazei, cuprinde un domeniu extracelular scurt (O- și N-glicozilare), domeniul transmembranar (23 Reziduuri) și o parte mare intracelular. În această parte, există un număr de resturi de tirozină supuși fosforilării-defosforilare. La numărul de referință 1030 este un rest de lizină, aparține situsul catalitic activ - site-ul de legare a ATP. Substituirea lizină a multor alți aminoacizi (prin mutageneza experimentală) RI anihilează activitatea tirozin kinazei, dar nu perturbă legarea insulinei. Cu toate acestea, legătura dintre insulină și astfel de RI nu are niciun efect asupra metabolismului și proliferării celulare.
Cascada de autofosforilare RI implică 6 sau 7 resturi de tirozină, principalele dintre acestea fiind resturile la pozițiile 1158, 1162 și 1163 (domeniul de reglare a kinazei). În autofosforilarea, un lanț b-fosforilă un alt lanț b din aceeași moleculă RI. În plus, în subunitatea b, există un număr de centre Cere / Trephosphorylation, al căror rol rămâne neclar. În unele studii, s-a descoperit că Cere / Trefosforilarea reduce afinitatea pentru insulină și activitatea tirozin kinazei RI.
Fosforilarea b subunitate la rândul său, conduce la o specificitate de substrat alterat al enzimei: Acum este capabilă să fosforileze alte proteine intracelulare - substraturi RI: proteine RI-C1, Shc și altele. Activarea și modificarea specificității sunt cauzate de modificările conformaționale în RI după legarea insulinei și autofosforilarea.
Multe modificări ale subunităților a în experiment (de exemplu, scindarea parțială a proteazei) conduc, de asemenea, la apariția activității Tyr-protein kinazei. Aceasta permite să se considere o subunitate ca subunitate regulatoare a enzimei: lipsa de insulină în această subunitate inhibă subunitatea catalitică activă constitutiv (adică b subunitatea).
Receptorii tirozin kinazei sunt o familie de proteine care includ mai multe clase. RI aparține clasei II, care este caracteristică pentru membrii prezenței domeniului bogat în cisteină în o catenă și o heterotetramerice -S-S-legaturile dintre protomers. Acestei clase îi aparține și IGF-I receptor (IGF-I), este extrem de omolog receptorului pentru insulină. Receptori de clasă I - monomeri; Clasele III și IV - aceiași monomeri, conțin repetitive de tip imunoglobulină din partea extracelulară.
astfel RI - tirozina stimulată de insulină, controlată strict de o cascadă complexă de autofosforilare tirozină (reglarea pozitivă) și serină / treonină (eventual - downregulation). Tirozina - intermediar obligatoriu toate (sau aproape toate) acțiunile pleiotropice de insulină, deoarece în ATP mutațiilor regiunii de legare conduce la pierderea capacității de a RI autofosforilarea și capacitatea de reacție celulară la insulină.
Legarea insulinei la receptor servește, de asemenea, ca un semnal pentru inițierea mișcării complexului de insulină / RI de la microvilli la acele zone ale suprafeței celulare unde nu există microvilli. Acest procedeu necesită, de asemenea, autofosforilarea dependentă de ligand a subunității b și activarea kinazei. Apoi, complexul de insulină / RI interacționează cu carierele cu fringi de clathrin și este internalizat. Mai mult, RI revine fie la membrana plasmatică, fie este inclusă în lizozomi și este distrusă. În multe tipuri de celule, insulina stimulează endocitoza și degradarea RI. Acest proces poate fi considerat un mecanism pentru reglarea negativă a acțiunii insulinei: o scădere a cantității de RI pe membrană și, prin urmare, slăbirea semnalelor declanșate de insulină poate fi semnificativă pentru celulă. Sinteza moleculei RI tetramerice este codificată de un ARNm și, ca rezultat al traducerii, se formează un lanț peptidic de mare moleculară. Completarea post-translațională începe în reticulul endoplasmatic - glicozilarea, formarea legăturilor intracelulare și inter-lanț-S-S. În continuare, în aparatul Golgi, apare o modificare proteolitică - scindarea unui singur lanț peptidic, formarea unei molecule tetramerice, glicozilarea terminală și acilarea cu un acid gras.
2. Receptorul de insulină activat fosforilează anumite proteine citoplasmatice, substraturile receptorilor
Mai multe substraturi RI: RI-C1, C2-RI, Shc, precum și unele proteine din familia de STAT (traductor de semnal și activator de transcripție, purtători de semnal și activatori de transcriere). Ele activează căi de semnalizare diferite. Substratul 1 al receptorului pentru insulină (RI-C1) este principalul. Această proteină citoplasmică este fosforilată de resturile de tirozină imediat după stimularea cu insulină. Fosforilarea substratului RI conduce la o reacție pleiotropică a celulei la semnalul de insulină. Gradul de fosforilare a substratului depinde de creșterea sau scăderea răspunsului celular la insulină, amplitudinea modificărilor în celule și sensibilitatea la hormon. Șoarecii din linia de laborator care nu au gena RI-C1 prezintă rezistență la insulină și toleranță redusă la încărcarea cu glucoză. Acest lucru indică faptul că deteriorarea genei RI-C1 poate fi cauza INHD.
Lanțul peptidic al lui RI-C1 conține puțin mai mult de 1200 de resturi de aminoacizi, 20-22 situri potențiale de fosforilare a tirozinei și aproximativ 40 de centre de Cere / Trefosforilare:
Structura substratului 1 al receptorului de insulină. Numerele sunt poziții ale resturilor de tirozină; în cadrul - resturi de tirozină fosforilate; săgețile sunt locurile de legare preferențială a proteinelor care conțin domenii SH2
În starea bazală, RI-C1 este fosforilat de serină (într-o măsură mai mică - de treonină); după stimularea cu insulină, gradul de fosforilare atât în tirozină, cât și în serină crește semnificativ. RI-C1 este, de asemenea, un substrat al factorului de creștere asemănător insulinei (IGF-I), care îl fosforilează în aceleași locuri ca și RI. Receptorii unui număr de alți factori de creștere (de exemplu, PDGF, EGF, CSF-1) nu fosforilează RI-C1.
RI-S1 fosforilarea a mai multor resturi de tirozină, îi conferă posibilitatea de a se conecta la un număr de proteine care conțin SH2-domenii. Aceste proteine sunt deosebit de Nck, tirozinfosfatază SYP, p85-subunitate a PI-3-kinazei proteină adaptor Grb2, protein tirozin fosfatazei SH-PTP2, fosfolipaza Cg, GAP (activator proteinelor mici cu legare de GTP). Ca rezultat al interacțiunii dintre RI-C1 și astfel de proteine, se generează mai multe semnale descendente.
Asocierea ne-covalentă a proteinelor apare datorită interacțiunii domeniilor SH2 cu secvențele de aminoacizi RI-C1 conținând restul de tirozină fosforilată. Cu toate acestea, nu toate proteinele care conțin domeniile SH2 sunt atașate la RI-C1: de exemplu, fosfolipaza Cg sau GAP nu este atașată. Selectivitatea asocierii este determinată de secvența de aminoacizi din regiunea reziduului de tirozină fosforilată (totuși, domeniile SH2 sunt asociate cu o mică afinitate și fosfotirozină liberă). În acest mod, se pot forma complexe multicomponente de proteine care participă la transducția semnalului. Acest mecanism nu este o caracteristică specifică a semnalizării insulinei: atunci când sunt transmise semnale de la receptorii factorului de creștere, citokine, etc., se formează, de asemenea, complexe cu proteine care conțin domenii SH2.
În unele proteine care conțin domenii SH2, precum și în proteine citoscheletale se găsesc domeniile SH3; aceste domenii pot interacționa cu secvențe bogate în prolină ale altor proteine.
3. Semnalul insulinei activează fosfatidilinositol-3-kinaza
Insulina mediază RI-C1 activează fosfatidilinozitol-3-kinaza (FI-3 kinază). Fl-3-kinaza catalizează fosforilarea FI, FI-4-P și FI-4,5-P2 în poziția 3; sunt formate respectiv FI-3-P. FI-3,4-P2 și FI-3,4,5-P3:
Enzima este un heterodimer care conține o subunitate de reglare (p85) și catalitică (p110). Subunitatea de reglementare are două domeniu SH2 și SH3-domeniu, cu toate acestea PI 3-kinazei cu afinitate mare se alătură RI-C1. Domeniile SH2 izolate derivate din p85 (o subunitate de reglare) inhibă formarea complexului cu FI-3 kinaza intactă. Rezultă că enzima atașează RI-C1 la subunitatea sa de reglementare. Când se formează complexul, FI-3 kinaza este activată.
Activarea căii de semnalizare a PI 3-kinazei este o legătură care stimulează GLUT-4 translocarea din citosol în membrana plasmatică și, prin urmare - și transportul transmembranar al glucozei în celulele musculare și adipoase. Inhibitorii FI-3 kinazei inhibă atât absorbția bazică, cât și cea absorbită de insulină; în ultimul caz, translocarea GLUT-4 pe membrană este inhibată. In studiile cu culturi de celule musculare rezultate obținute permit să-și asume următorul lanț de evenimente la stimularea captării glucozei prin insulină: RI-C1 ® PI 3-kinazei ® PK-C ® GLUT-4 translocare. Protein kinaza C in vitro este activată direct de polifosfoinozitide. Mecanismul activării in vivo nu este cunoscut.
În celulele de grăsime, activarea FI-3 kinazei de către insulină duce la inhibarea lipolizei. Stadiul limitator al lipolizei în adipocite este o reacție catalizată de o lipază sensibilă la hormoni, care este activă într-o formă fosforilată (fosforilare dependentă de cAMP). După stimularea cu insulină concentrației cAMP în adipocite scade ca urmare a următorului cascada de reactii: fosforilate (și activat) protein kinaza B (PP-B), care fosforilează (și activează) cAMP fosfodiesterazei:
La o concentrație scăzută de cAMP, lipaza este în starea inactivă ne-fosforilată. Pe scurt, calea semnalului de la insulină la fosfodiesterază poate fi reprezentată după cum urmează: insulină (FI-3 kinază). / PC-B / PDE. Legăturile intermediare dintre FI-3 kinaza și PC-B nu au fost studiate.
Mulți factori de creștere stimulează FI-3 kinaza, dar nu afectează metabolismul glucozei. Aceasta indică faptul că diferitele intrări de semnal au mecanisme specifice pentru utilizarea sistemului FI-3 kinazei pentru a genera un răspuns final specific.
Insulina și factorii de creștere care acționează prin receptorii T-kinazei activează kinazele PH-3 de clasă 1 construite din subunitatea catalitică de 110 kDa și subunitatea adaptor p85. În țesuturile dependente de insulină, s-au găsit două forme ale subunității catalitice, p110a și p110b. Sunt cunoscute de asemenea două forme ale unei subunități adaptor și r85a r85b cu omologie ridicată cu secvența de aminoacizi și structura spațială: fiecare dintre ele cuprinde două SH-domeniu, două domenii bogate în prolină, SH3-domeniu și domeniul Bcr-omolog. În plus, s-au găsit câteva forme trunchiate ale subunității adaptorului: acestea nu conțin domeniul SH3, domeniul omolog de Bcr și unul dintre domeniile bogate în prolină. În adipocitele umane, se exprimă numai subunitatea adaptorului p85a, în timp ce în celulele musculare scheletice există 7 variante: p85a, p85b și cele cinci trunchiate. Diferitele variante ale proteinelor adaptorului nu sunt incluse în complexele fosfotirozinei în același mod cu stimularea cu insulină. Aceste rezultate indică posibilitatea de ramificare a căii de semnalizare datorită mobilizării selective a unei variante specifice a proteinei adaptor (sau a unui set specific de proteine adaptor), în funcție de natura stimulului primar.
4. Insulina activează calea de semnalizare Ras
Proteinele Ras sunt incluse în superfamilia proteinelor mici care leagă GTP. Acestea sunt proteine mici (greutate moleculară 21 kDa, circa 190 resturi de aminoacizi) conținând la capătul C un rest farnesil sau geranil legat covalent:
Folosind acest capăt hidrofob, proteinele Ras (p21ras) se atașează la suprafața interioară a membranei plasmatice. Ras sunt implicați într-o varietate de procese celulare, inclusiv transport vezicular, funcții chaperon, proliferare.
Ca toate proteinele care leagă GTP, Ras sunt reglate de un ciclu de proteină GTP-proteină (formă activă) U GDF-proteină (formă inactivă). Aceste transformări implică și alte proteine: GAP (factor de activare GTPază), GEF (factor de schimb GTF) și SOS; cele două proteine din urmă asigură separarea GDF de Ras și adăugarea GTP.
În celula de odihnă, p21ras este predominant într-o formă GDF inactivă. Stimularea celulei cu insulină (precum și alți factori de creștere și mitogeni) conduce la o creștere rapidă a cantității formei active GTP. Exista urmatoarele: proteină citozolică mică Grb-2 (receptor de creștere legat de proteine factor), care conține SH2- și SH3-domenii se pot alătura covalent RI fosforilate în anumite reziduuri fosfotirozină:
Activarea căii de semnalizare a insulinei Ras / MAPK. Nu sunt prezentate toate proteinele menționate în text. Dispunerea spațială a proteinelor „clustere“ pe planul de afișare nu este posibilă: de exemplu, active Raf-1-k de contact nu numai cu Ras-GTP, dar, de asemenea, cu membrana plasmatică, cu receptorul de insulina si alte proteine.
Această interacțiune este facilitată de unul dintre substraturile RI, și anume Shc. Apoi complexul format interacționează cu un alt complex care conține proteina Ras (p21ras). Proteinele Grb2 și Shc sunt, de asemenea, numite proteine adaptor, deoarece leagă receptorii tirozin kinazei (în acest caz RI) la proteina Ras. Complexul include, de asemenea, proteine care asigură schimbul de GDF / GTP și activarea Ras (SOS, GAP, GEF, OST). O mare grămadă de forme de proteine interacționează pe partea citoplasmatică a receptorului de insulină. Astfel, insulina activează proteina Ras, iar calea semnalului de insulină se leagă de calea de semnalizare Ras.
Activarea Ras este legătura finală a transmisiei semnalului transmembranar și legătura inițială a căilor de semnalizare citoplasmatice și nucleare. Aceste căi cuprind o cascadă de reacții care implică protein kinaza Raf-1 protein kinază, MAPKK (activat protein kinaza mitogen-kinazei) și MAPK (mitogen-activat protein kinaza). Ras activat dobândește capacitatea de a se lega de proteina kinaza Raf-1. Raf-1 este în citozol în combinație cu unele proteine de șoc termic și, în această stare, nu are activitate protein kinazică; Enzima este activată ca urmare a legăturii cu proteina Ras. Acest proces este complex: pentru activarea completă a Raf-1 necesită atașarea lui la membrana plasmatică, fosforilarea enzimei de tirozin ostakam sarkokinazoy (Src), fosforilare la resturile de serină și treonină ale unei anumite protein kinazei C, precum și interacțiunea cu receptorul de insulină. Astfel, în acest moment, o grămadă de proteine pe receptorul de insulină crește și mai mult.
Proteina kinază activată Raf-1 fosforilează (activează) MAPCC, care fosforilează MAPK. MAPK activat fosforilează anumite proteine citoplasmatice (în particular - proteină kinază pp90S6, fosfipolază A2 și kinază ribozomală).
Semnalul poate fi de asemenea transmis la nucleu, asigurând reglarea transcripției anumitor gene: MAPK fosforilat favorizează (activează) un număr de factori de transcripție.
Calea Ras este activată nu numai de insulină și receptorul său, ci și de mulți alți hormoni, factori de creștere și receptorii lor. Aceste procese, în special, implică proliferarea și transformarea celulelor. Cu toate acestea, răspunsul final al celulei la semnale diferite este diferit, se dovedește a fi specific pentru acest primul mesager de semnal. Aceasta se datorează, în special, prezenței variantelor de proteine (familiale) implicate în transducția semnalului.
Activarea căii Ras cu insulină conduce, împreună cu alte răspunsuri celulare, la modificări ale metabolismului glicogen:
Reglarea sintezei de glicogen prin insulină prin calea de semnalizare Ras. PFGr-1 - proteină fosfatază de granule de glicogen; KF - kinaza glicogen fosforilază; GF - glicogen fosforilază; HS - glicogen sintaza. În cadrul cadrului sunt procese care, atunci când celulele sunt stimulate cu insulină, se termină datorită defosforilării glicogen fosforilaz kinazei.
Una dintre enzimele cascadei protein kinazelor activate de complexul Ras este proteina kinaza pp90S6. Această enzimă catalizează cererea / trifosforilarea proteinei fosfatazei legată la granule de glicogen (PFGp-1). Forma fosforylată (activă) a PFGp-1-P defosforilază (activează) glicogen sintaza (sinteza glicogenului este accelerată). PFGp-1-P defosforilează, de asemenea, fosforilaza kinază și glicogen fosforilaza (oprirea mobilizării glicogenului). Într-un mod atât de lung, semnalul de insulină atinge una dintre legăturile efectoare de capăt.