Lucrare de laborator nr. 2
Reacțiile de precipitare a proteinelor reversibile
Reacțiile de precipitare a proteinelor sunt reversibile și ireversibile. Cu precipitarea reversibilă a macromoleculei, proteina nu este, în general, supusă unei denaturare profunde, iar precipitanții pot fi re-dizolvați în solventul inițial. Răsăritul reversibil este cauzat de acțiunea sărurilor neutre ale metalelor de amoniu, alcalin și alcalino-pământos (sărate), alcool, acetonă, eter și alți solvenți organici.
Reactivi: soluție de proteină de ou, cu adăugare de clorură de sodiu (proteină de ouă de pui sunt separate din gălbenușul și se dizolvă în 230 cm3 de apă distilată, la care se adaugă 100 cm3 de soluție saturată de clorură de sodiu, soluția se filtrează prin tifon, împăturit în 3-4 straturi, și depozitate în frigider); o soluție saturată de sulfat de amoniu; sulfat de amoniu, pulverizat; Soluție 10% de hidroxid de sodiu; Soluție 1% de sulfat de cupru.
Echipamente: tuburi de testare; pâlnie pentru filtrare; filtre de hârtie.
Sarcina 1. Precipitarea proteinelor cu sulfat de amoniu.
- Într-un tub de măsurare se măsoară 2-3 cm3 de soluție de albus de ou, se adaugă un volum egal de soluție saturată de sulfat de amoniu și se amestecă amestecul.
- Precipitatul globulinelor dispare, albuminele rămân în soluție. Precipitați precipitatul pe un filtru de hârtie.
- Se adaugă pulbere de sulfat de amoniu în filtrat până se obține o soluție saturată (ultima porțiune nu este solubilă).
- Un precipitat de albumine, care, de asemenea, filtrează.
- Se filtrează cu un depozit de albumine, se clătesc 5 cm3 de apă, se colectează filtratul într-o eprubetă curată.
- Reacționează biuret cu filtrat. Sa dizolvat albumina?
Sarcina 2. Precipitarea proteinelor cu alcool.
Solvenții organici determină precipitarea proteinelor datorită distrugerii învelișului hidrat al macromoleculelor.
- Într-un tub de testare, se toarnă 1 cm3 de soluție de albus de ou cu adaos de clorură de sodiu.
- Trageți cu picătură 4-6 cm 3 de alcool și agitați viguros. După 5-8 minute. precipită proteinele.
Cu precipitații ireversibile, apare denaturarea profundă și agregarea proteinelor. Proteina denaturată nu este capabilă să-și restabilească proprietățile fizico-chimice și biologice inițiale. Precipitarea ireversibilă este cauzată de temperaturi ridicate, de acțiunea mineralelor concentrate și a unor acizi organici, ioni de metale grele, reactivi alcaloizi, detergenți, coloranți.
Reactivi: o soluție apoasă de albuș de ou (soluție preparată așa cum este descris în Laboratorul №1, sulfuric concentrat, clorhidric și acid azotic, soluție de acetat de plumb 5%, 2,5% soluție de azotat de argint -lea; soluție de sulfat de 5% cupru.
Sarcina 1. Precipitarea proteinelor cu acizi minerali.
Reacția este utilizată pentru determinarea rapidă a proteinei în fluide biologice, de exemplu, urină.
Acest lucru trebuie efectuat într-o hota de fum, având grijă deosebită!
- În trei eprubete, turnați 15-20 de picături de acizi concentrați: primul - acid sulfuric; al doilea - azot și al treilea - acid clorhidric.
- Sfatuiți tuburile la un unghi de 45 ° și ATENȚI (din pipetă) stratul de soluție de proteine de pe perete. Țineți tubul de testare de la tine. Un inel alb apare la limita dintre proteine și acid.
- Agitați ușor tuburile. Precipitarea se dizolvă în acizi sulfurici și clorhidrici, dar nu se dizolvă în acid azotic.
Sarcina 2. Precipitarea proteinelor cu săruri ale metalelor grele.
Proteinele sunt precipitate cu săruri de cupru, plumb, mercur, zinc, argint și alte metale grele. Proprietatea proteinelor care leagă ionii de metale grele este folosită în medicină atunci când furnizează prim ajutor victimelor otrăvirii cu săruri de cupru, plumb, mercur.
- În trei tuburi numerotate, se toarnă 5-10 picături de soluție proteică.
- În primul tub, se adaugă o soluție de acetat de plumb. Se formează un precipitat. Adăugați încă câteva picături, precipitatul trebuie dizolvat în soluție în exces de sare.
- Într-un al doilea tub de testare, se picură cu picătură o soluție de azotat de argint. Precipitatul format în excesul de sare nu este solubil.
- În cel de-al treilea eprubetă, se adaugă o soluție de sulfat de cupru până când apare un precipitat. Asigurați-vă că sedimentul se dizolvă în exces de sare.
Completați rezultatele studiilor sub forma unui tabel.
Denaturarea termică a proteinelor
Când sunt încălzite, proteinele sunt denaturate. PH-ul soluției și adăugarea de electroliți exercită o influență puternică asupra procesului de denaturare.
Reactivi: o soluție apoasă de proteine din ou (se prepară o soluție, așa cum este indicat în lucrarea de laborator nr. 1); Soluție 1% de acid acetic; Soluție 10% de acid acetic; Soluție 10% de hidroxid de sodiu; o soluție saturată de clorură de sodiu.
Echipamente: tuburi de testare, baie de apă sau lampă de iluminat.
- În cinci tuburi numerotate se toarnă 10 picături de soluție de ou alb.
- Proteina din primul tub de testare este încălzită la fierbere. Soluția devine tulbure (cojile de hidrat din jurul macromoleculelor se descompun), dar precipitatul nu se formează. Micelii formați de macromolecule păstrează aceeași încărcătură, ceea ce împiedică precipitarea lor.
- La soluția proteică din al doilea tub, se adaugă o picătură de soluție de acid acetic 1% și se încălzește la fierbere. Precipitația proteinei scade rapid. Încărcarea micelilor este neutralizată și proteina este aproape de punctul izoelectric.
- La soluția proteică din al treilea tub, adăugați 1-2 picături dintr-o soluție de acid acetic de 10% și încălziți până la fierbere. Sedimentul nu se formează, deoarece micellele de proteine sunt achiziționate, atașând ionii de hidrogen, o încărcătură pozitivă, care împiedică precipitarea lor.
- În al patrulea tub, se adaugă 1-2 picături de soluție de hidroxid de sodiu 10% și se încălzește la fierbere. Precipitatul nu se desprinde. Micielile datorate detașării protonilor din grupele carboxil ale lanțurilor laterale ale proteinei sunt încărcate negativ.
- În a cincea eprubetă adăugați 1-2 picături de soluție saturată de clorură de sodiu și încălziți la fierbere. Proteina precipită.
Completați rezultatele studiului completând tabelul și înregistrând pe scurt mecanismul efectului de denaturare al factorului investigat sub forma unei concluzii.