Kazmirchuk Vera Evstafievna, MD, profesor, director
Malțev Dmitri Valerievich, PhD,
Director adjunct al Institutului de Imunologie și Alergologie Bogomolets National University Medical
Metoda 1.Virusologichesky. esența care este de a separa virusului în culturi celulare sensibile (de exemplu, fibroblaști) sau oua embrionate de pui rămâne încă „standardul de aur“ pentru diagnosticul infecțiilor virale la om, deoarece sensibilitate ridicată (85-100%) și specificitate (100%), permite obține cultura virusului curat pentru studii suplimentare, în special susceptibilitatea testul antiviral. Cu toate acestea, costurile și complexitatea semnificativă a preveni adoptarea sa la scară largă în practica clinică de rutină. rezultate tehnica virologice obținute prea târziu (de la 2 la 14 zile) pentru a utiliza astfel de diagnosticare în situații de urgență (de exemplu, encefalita virală sau septicemie).
microscopie 2.Electronic dezvăluie particule virale în probă pentru a determina specia virioni prin caracteristicile lor morfologice, dar această metodă malodostupen pentru practica clinică și este utilizat în principal în scopuri științifice.
proba 3.Biologicheskaya consta in infectarea animalelor de laborator sensibile (șoareci albi sau iepuri) biomaterial derivate dintr-o infecție cu herpes pacient; Metoda poate fi utilizată în caz de litigiu, infecția cu virusul herpes, de exemplu, pentru diagnosticul de encefalita herpetică atipice.
a) hibridizare ADN - o metoda foarte specifice pentru a identifica genomul virusului după hibridizarea molecule de ADN complementare. Metoda măsoară capacitatea hibridizabil ADN-ului viral în studiu (în mod specific se leaga) cu ADN complementar marcat de origine cunoscută, prin care se concluzionează identificarea speciilor a eșantionului. Specificitatea acestei metode este direct proporțională cu lungimea lanțurilor de polinucleotide complementare. Deoarece enzimele marker de utilizat (de exemplu, peroxidaza, fosfataza alcalină) sau izotopi. In plus, pentru a detecta hibridizarea fenomenului gelului de electroforeză, care permite să se diferențieze mobilitatea electroforetică a ADN-ului complementar și complexul „ADN complementar. - ADN-ul virusului“
b) reacția în lanț a polimerazei (PCR) - metoda de astăzi diagnostic cele mai utilizate pe scară largă de infecții cu herpes la om, care a oferit Myullis în 1983. Metoda se bazează pe ADN-polimerazei repetată formarea catalizată de enzimă de copii (amplificare) a unei anumite porțiuni de ADN care reprezintă un interes de diagnostic. Astfel, pentru amplificare, adică, sinteza ADN-ului șablon, selectați partea cea mai conservatoare a genomului viral, de obicei, unele gene unice care se distinge cel mai clar de alți agenți patogeni. etapele metodei:
1) separarea termică a moleculelor de ADN dublu catenar asupra lanțurilor individuale (30-40 secunde la 93-95 ° C);
2) răcirea mediului;
3) introducerea primerilor specii specifice. și anume fragmente de ADN, secvențe de nucleotide complementare ale ambelor catene ADN ale testului agentului patogen; pentru a începe sinteza pe un șablon ADN folosind doi primeri care sunt complementari spiralele ADN la ambele capete ale fragmentului specific;
4) introducerea unui ADN polimerază termostabilă care începe formarea de copii secundare ale ADN-ului;
5) reîncălzire;
6) mediu de răcire;
7) reintroducerii primeri;
8) repetarea procedurilor de încălzire și răcire;
9) după 30-80 cicluri de acumulare de copii de ADN de identificare ale acestora se realizează prin electroforeză sau metodă de imunofluorescență [31].
Interacțiunea dintre primerii cu ADN polimerază și matriță de ADN numit recoacere. deoarece reacția are loc în 20-30 de secunde la 50-65 C. Ca rezultat spiralele ADN dostraivaniya la un fragment specific de ADN polimerază este formată dintr-un fragment specific - amplicon. Astfel, ampliconul cuprinde matriță de ADN cu lanț, primer și la acesta neterminat printr-un fragment de ADN polimerază al lanțului de polinucleotide. După cum sa menționat mai sus, după primul ciclu se repetă, și sintetizat le amplicons servesc ca șabloane pentru fazele ulterioare. În acest caz, se calculează că 30-40 cicluri de una matrice poate produce aproximativ 10 amplicons August (Fig. 1).
Fig. 1. Diagrama schematică a stadializare PCR
Distins de calitate. variante semi-cantitative și cantitative ale metodei. Când se efectuează calitativ PCR poate identifica simplul fapt al prezenței virusului, dar este imposibil de a evalua activitatea reproductivă, ceea ce este inacceptabil în diagnosticul infecțiilor cu herpes, în care este necesar să se efectueze un diagnostic diferențial între formele latente, persistente și reactivate de infecție. PCR semi-cantitativă oferă unele informații cu privire la conținutul de copii ale ADN-ului viral, care se exprimă sub formă de simboluri (+, ++, +++, ++++), dar este cel mai avantajos să efectueze varianta cantitativă a metodei, cu care este posibil să se obțină valori numerice exacte.
Trebuie înțeles faptul că un rezultat cantitativ obținut nu corespunde conținutului real al ADN patogen din proba de testare, datorită amplificării fenomenului, care are loc în timpul PCR. Cu toate acestea, există încă o anumită proporționalitate între cantitatea de material genetic al sursei și rezultatul final al studiului, care se observă numai în cazul diagnosticării în condiții standard, folosind aceiași reactivi. Prin urmare, aceste date pot fi utilizate în diagnosticul clinic, în cazul în care vom efectua examinarea pacientului în timp, în același laborator. Dacă este necesar să se stabilească cantitatea absolută a ADN-ului viral în proba este realizată apoi normalizarea rezultatelor obținute (comparație cu o anumită cantitate de produse stabile de gene a căror expresie este aceeași în diferite condiții).
PCR permite principalele dezavantaje ale metodei de hibridizare ADN-ului, în particular este caracterizat de o sensibilitate ridicată, din cauza creșterii artificiale a conținutului de acid nucleic viral în materialul de testat. De asemenea, datorită acestei reacții este mult accelerată în timp ce rezultatul.
PCR - o metodă extrem de precisă; teoretic, suficientă pentru a obține rezultatul de a avea un mediu numai o moleculă de ADN a agentului patogen. Sensibilitatea PCR este de 98% și o specificitate - 94%. rezultate fals negative sunt posibile nerespectarea procedurilor tehnologice ale studiului, precum și utilizarea unor reactivi de calitate slabă. Date fals pozitive pot fi obținute la calcularea rezultatelor metodei electroforeză, care este asociată cu contaminarea aerului înconjurător amplicons spațiului de lucru obținute în formulări preliminare. Prin urmare, utilizarea așa-numita metodă deschisă de calcul a rezultatelor necesită o ventilare intensivă de camere. Este mult mai bine de a utiliza o tehnici de numărare închise, cum ar fi detectoare de imunofluorescență, în care nu există nici un contact direct între produsele de reacție și mediul de aer, precum și rezultatele studiului sunt mai corecte.
Metoda cea mai exactă este timePTsR așa-nazyvaemoyreal. și anume PCR în timp real. Caracteristica sa distinctivă este cantitatea de calcul al ADN amplificat ca acumularea lor după fiecare ciclu de amplificare, mai degrabă decât la sfârșitul producției. Acesta utilizează două metode de înregistrare rezultate: folosind fluorescente „vopsea“. care interacționează direct cdvutsepochechnoy ADN-ul și pentru a asigura strălucirea și sonde modifitsirovannyhDNK-oligonucleotide (Fig. 2, 3). Acestea din urmă conțin secvențe ADN specifice complementare gene unice studiate patogen, precum fluorofor și „quencher“ (stingator), legată la o moleculă purtătoare, numit un reporter ( „vector“). Fluorofor detașat de „absorbant“, și oferă un fenomen de luminescență numai după hibridizare cu oligonucleotide specifice secvențe complementare cu ADN-ul în curs de investigare.
Chiar și PCR cantitativă nu întotdeauna distinge în mod adecvat între latetnye și infecție reactivat, deoarece există prezența ADN-ului viral în ambele cazuri. Pentru un astfel de diagnostic diferențial, folosind transcripție inversă PCR (reversetranscription PCR), prin care se poate calcula cantitatea de ARNm viral, care indică intensitatea expresiei genelor virale. Cantitatea mare de ARNm al patogenului indică infecția reactivată.
1 - sondă intactă (fluorofor și quencher sunt asociate unele cu altele); 2 - proba este hibridizat cu o catenă complementară a ADN-ului țintă; 3 - sub influența ADN polimerazei probă este distrus și eliberat fluorescente (glow efect)
Secțiunea VE cărți Kazmirchuk, DV Malțev
„Clinica, diagnosticul și tratamentul infecțiilor cu virusuri herpetice la om“