Infecția cu rotavirus (RVI), bovine (diaree, vițel nou-născuți) - ostroprotekayuschih boală contagioasă a vițeilor nou-născuți, caracterizate prin leziuni ale tractului gastrointestinal. Boala este larg răspândită în toate regiunile geografice ale globului. Practic reînregistrat, ori de câte ori a efectuat cercetări. Rotavirus larg dissiminatsiya dovedit (RV), viței la animale din specii diferite și prezența anticorpilor la rozătoare (cobai, șobolani, hamsteri, șoareci).
epizootică Pe baza, datele clinice și patologice da un diagnostic preliminar, numai finale metode set laboratornm. Ultimul se bazează pe detectarea virusului sau a hipertensiunii virale la pacienții cu fecale de viței, conținutul intestinului, celulele mucoasei intestinului subțire a animalelor căzute și sacrificate, precum și pe identificarea anticorpilor la PB în seruri de pacienți cu și de a recupera de la viței și ser și colostrul de vaci -materey.
Metode de diagnosticare rapidă. Dezvoltarea test ELISA sistem bazat pe detectarea porcilor CM specifice RNC PB AG, care are o sensibilitate și specificitate mare. recomandabil sa de a utiliza in laborator pentru diagnostic rapid. Deoarece polipeptida VR5 cuprinde cruce Group AG-localizate Vanny un domeniu conservat care este comun pentru toate grupul RV A. În părea posibil indicație rota- și coronavirusul prin sonde fluorescente și anticorpii acestora. Ea se bazează pe înregistrarea etapelor timpurii ale interacțiunii virusului cu celule receptor-E.
Izolarea virusului. În laborator timp de cel puțin 10 probe directe fecale lichide, conținutul intestinului subțire (nu mai târziu de 2-3 ore după moartea sau sacrificarea vițeilor stimulate), 10-15 probe si seruri pereche de pacienți bolnavi cu stomac-TION, probele de ser 6-10 sângele vacilor și 6-10 probe de colostru. Cu cel mai mare virus constanță poate fi detectată în probele de fecale prelevate în primele zile de boală, așa este, ca urmare fecale adecvate luate din vițeii 2-14 zile cu semne clinice de diaree în boala de 1-3 zile. Imediat după livrare la probele de laborator tratate cu sau depozitate la 4 ° C nu mai mult de o zi, la -20-50 ° C până la 1 lună. Ser depozitat la 4-10 ° C timp de până la 1 săptămână la -20 ° C până la 1 lună; Colostrum - la 4 ° C timp de până la 2 zile la -20 ° C - până la 1 lună. Pentru examinarea virusologică sau microscopie electronică se prepară din 10% suspensie de fecale pe p-D Hanks. Suspensia a fost omogenizat și centrifugat timp de 1 oră la 3 mii. Rev / min, supernatantul a fost transferat într-un flacon steril, a adăugat fin tsillin și streptomicină (1000 U / ml) și incubate timp de 10-12 ore (peste noapte) la 4 ° C și testat.
Izolarea PB în culturi de celule. O corelație între DECLARAÞII-boala novoro vițel diaree cu prezența hipertensiunii RV în materiile fecale. Trebuie să se țină cont de faptul că de obicei-guvernamentale înseamnă că virusul nu este cultivat, precum și utilizarea de impacturi suplimentare - Chi-nomic (tripsina) și fizică (centrifugarea virusului pe stratul de celule) - oferă rezultate zhitelnye polo în concentrații mari ale virusului in fecale, care pot fi verificate electronic microscopie. În acest scop, conținutul unui tub după congelare și decongelare și tratamentul cu polietilenglicol resuspendat în 0,1 ml apă distilată și se examinează cu un microscop electronic. În cazul exponatul pozitiv Ti-pichnye particule PB și clusterele. Natura specifică a particulelor confirmate Meto-house microscopie immunoelectron.
Dacă un rezultat pozitiv particulele PB detectate în preparatele de concentrații Spec-ically (complexe imune). Evaluarea specificității reacției este realizată prin numărarea numărului și mărimii acestor grupuri, precum și cu privire la gradul de acoperire a virionilor individuale AT ser. Intensitatea acestui efect în anumite aptitudini, pot fi evaluate pe o scală de unități arbitrare de la 0 la 4 avantaje.
IF. metode directe și indirecte utilizate cu succes pentru detectarea virale AG în secțiuni înghețate ale intestinului subțire, fecale maz-Kah și cultura celulară. În criosectiuni anchetă dovanii și frotiurilor intestinali de la viței fecale cele mai bune rezultate sunt obținute în termen de 4-6 ore după detectarea semnelor de diaree. Celulele epiteliale deskva-miruyutsya rapid din suprafața vilozităților intestinale și scos din materiile fecale. Cel mai adesea suspensia fecale infectează cultura de celule si virale identifica hipertensiune în re-acțiunea IF. IF a dezvoltat o metodă directă în celule MDBK infectate cu cultura sau materialul viral fecale. Recomandările metodologice pentru PB katsii indiu-RNC IF metodă indirectă prevede utilizarea unui kit de diagnostic care cuprinde antigen specific - celule Zia-PEC susp cultură conținând virusuri sau MA-104; AH normal - neinfectat PEC suspensie celulară sau AI-104; zer specific obținut prin hiperimunizare viței-evaluate-LABO animale; ser normal de bovine sănătoase, care nu conțin anticorpi la PB; antispecies ser împotriva globulină bovine conjugat FITC (eliberat Ying-tute de Epidemiologie si Microbiologie. Gamaleya). NIF poate fi folosit pentru a detecta și identifica PB AG în culturi celulare infectate, excrementele și viței ki-shechnike bolnave sau moarte pentru detectarea și cuantificarea anticorpilor la PB.
RDP. Aceasta este - o metodă simplă și accesibilă pentru detectarea hipertensiunii RV la pacienții cu fecale de viței, conținutul intestinului și suspensia mucoasa intestinală a vițeilor stimulate sau căzute, a ucis-o zi. În acest scop, o suspensie de fecale 20% tamponată cu fosfat salin p re-încălzit într-o baie de apă la 37 ° C timp de 30 minute, amestecând din când în când. Apoi preț-trifugiruyut 15 min la 8000 g. Supernatantul a fost filtrat printr-un „Millipore“, iar filtratul a fost concentrat de 25 de ori folosind un hub de dializă. În rezultatele, toate prelucrările steps Tate 0,2 ml concentrat corespunde la 1 g de material de pornire FEKA-ly. Sursa de anticorpi specifici sunt ser convalescent după gastroenterita cu rotavirus-TION, pretestate în alte teste serologice.
PDR se realizează într-un gel de agaroză pe placă de sticlă de 0,9% agaroză într-un p-D tampon conținând 0,1 M NaS1, 0,01 M tris (hidroximetil) aminometan și 0,001 M etilendia-mintetraatsetata. Componentele de reacție au fost plasate în tăietură în agaroză gaura strat dia-metru 3 mm, distanțate de 3 mm. Plăcile cu gelul să stea peste noapte la temperatura camerei, după care se ia în considerare rezultatele. Între godeurile cu hipertensiune și AT în cazurile pozitive, au format o linie clară de precipitații. PDR este testat AG - parte fecale lichide sau supernatant după centrifugarea unei suspensii de fecale sau intestinal sub seruri de testare de la convalescenți viței molozi cantitate și lapte în forma sa naturală (ca ser) după tratamentul cu cheag.
reacția Imunoprecipitarea precipite anticorpi fluorescenți pătate pot fi aplicate dlyaobnaruzheniya in fecale de om și PB PB vițel diaree. Dezvoltat-tang exprima modificarea acestuia. Diagnosticum conținând ser normal specific și hipertensivă specifice preparate prin procedura VIEV și ca utilizarea pe termen normal ser fetal de ser sau ser bezmolozivnyh viței. Re-estima ponderea liniilor caracteristice formarea unui precipitat.
RSK. Pentru a identifica hipertensiune este folosit mai rar decât alte metode. Este mai puțin sensibilă decât microscopia electronică și RIF, de multe ori dă rezultate fals pozitive din cauza anticomplementare multe probe de fecale. Cu toate acestea, tratamentul fecale completează, ser fetal, freon, purificarea prin ultracentrifugare PEG 6000 sau RAC nu inferior in sensibilitate microscopie electronica. Reacția a fost pus micrometodă cu ser sau ser specific a fost recent vițeii bolnavi liber de anticorpi alte virusuri.
WIEF. În această reacție, se formează între hipertensiune linie de precipitare, se deplasează spre anod, iar AT, se deplasează spre catod. Calitatea și puritatea sunt principalele set-agaroza facto obține rezultate reproductibile. Cei mai mulți cercetători cred că acest test nu este inferior la microscopia electronică de, sau chiar depășește.
VIEF propusă pentru detectarea CM în fecale și material patologic și pentru detectarea anticorpilor din seruri. Pentru a studia sarcina de fecale lichide. Dacă porțiunea lichidă a studiului este insuficient, probele de fecale au fost centrifugate 10-15 min la 4 th. Rev / min, la 4-10 ° C Examinați supernatantul. Intestinul fin pulverizate, a adăugat volum egal de fiziologice r-ra, apoi omogenizat într-un mojar cu sticlă, centrifugat 2 minute la 10-15 mii. Rev / min, la 4-10 ° C Supernatantul este utilizat în reacție.
VIEF da o re-p th 0,85% preparată agaroză în M tampon 0,5 veronal-medinalovom (pH 8,6).
ELISA. Sensibilitate mai mare decât EI, IP, RSK, WIEF. Poate fi folosit-van în opțiunile directe și indirecte, precum și punerea pe latex. Utilizarea ELISA poate fi detectată în fecale vițeii PB la o diluție a probei de testat la 1: 5000. Opie-san fază solidă ELISA pentru tipizarea și împărțirea în subgrupe PB uman și burta TION. În acest scop, IgG la 5 ug / ml; antisyvo diluție de iepure IgG ROTKO la CRN la 1: 400. Durata de incubare, IgG -4 ore, cu reacția PB AG IgG -3 h, reacția antiserului la complex IgG cu PB - PB AG -16 ore, pentru un compus cu conjugat - 4 ore, pentru a schimba culoarea (p-nitrofenil fosfat) substrat - 10 min. Investigațiile Înainte de-dovaniem vitei fecale diluat de 4 ori cu tampon fosfat p-rom, clarificat tsentrifu-girovaniem și tratat cu un amestec de Tween-20 cu azidă de sodiu. Indicații ELISA în acord 100% cu rezultatele microscopie electronica.
Un sistem de testare bazat pe ELISA pentru a detecta porci RV specifice RNC PB AG, care are o sensibilitate și specificitate mare. În România, dezvoltat de imunotestare enzimatică kit de diagnostic VIEV fabricat. Kitul include: un anumit liofilizat PB AG - șlam care conține virusul obținut în cultura de celule MA-104, un PEG concentrat, 6000 și centrifugat la 6000g, controlul tensiunii arteriale syvo este liofilizat-rotavirus specific ROTKO obținut prin hiperimunizarea iepuri sau viței virus purificat într-un gradient de clorură de rubidiu densitate; imunoglobulinele uscate și izolate din ser rimmunnoy rotavirus Gypea prin sărare cu un p-rom saturat (NH4) 2 SO4 urmată de cromatografia de schimb ionic pe o coloană de DEAE-celuloză.
Există mai multe alte metode pentru a identifica PB AG în fecale de viței cu diaree :. Reversed pasivă reacție hemagglutination immunoagregatnoy metoda GA, aglutinare latex etc. Astfel, se furnizează o metodă simplă pentru a detecta PB stafilococică-TION în fecalele vițeilor nou-născuți folosind ser de iepure celor PB-lyat. Metoda se bazează pe detectarea aglutinant aureus CM în 10% din fecale susp-mostre pe lame Sion cu Staphylococcus aureus, încărcate PB AT. stafilococii Controlul sunt tratate cu ser de iepure non-imun. Aglutinarea este vizibil la microscop după 2-3 minute după sticla pendulare circular. Pentru a evita reacțiile nespecifici efectuate pretratare probe de fecale prin încălzire, filtrare și N-acetilcisteina. Un astfel de tratament nu reduce metoda spe tsifichnosti. În comparație cu metoda ELISA sa dovedit a fi sensibile; Advan-Tage a lui - viteză, simplitate și costuri reduse, este important să ecran pentru numărul de durere-Shogo de probe de fecale.
Metoda de aglutinare cu latex, folosind un kit comercial vă Rotaleh efecte RV în materiile fecale ale pacienților cu metode specifice ca, sensibil, precum și de microscopie elec-Tron, ELISA și IF. Pentru a diferenția subgrupele și serotipuri ale RV izolatele descrise hibridizarea acidului nucleic, electroforeză PAGE virusuri ARN virionului. Metoda de hibridizare spot este foarte specific, se poate detecta 8 ng de ARN viral și de 10-100 de ori mai sensibile decât ELISA.
Identificarea variantei folosind mAb. S-a obținut mAb în bucăți. RIT4237 (serotipul I) PB RNC. Neutralizarea AG a relevat o specificitate variabilă pentru grup și subgrupului determinanților. Utilizarea mAbs împotriva subgruppovyh AG în ELISA a fost stabilită seroprevalența II persoană PB în probele de fecale de copii bolnavi. Prezența unor astfel de anticorpi crește sensibilitatea și specificitatea sistemelor de testare.
Serodiagnosis și diagnostic retrospectiv. Testarea serologică a serului sanguin de viței are un preț-Ness foarte limitat. În primele săptămâni de viață nu poate detecta AT creștere, în ciuda bolii trecut. Nivelul anticorpilor umorali la animalele adulte nu permite ocurență-prognostication zată epizootiilor din efectiv.
RSK. Pentru diagnosticul de RVI prezinta posibilitatea de a stabili asociat cu RSK-syvo Rothko a fost animale bolnave. In primele zile boala KSA la majoritatea animalelor de la-absență. Prin Ziua 7-10 crește nivelul lor, atingând un maxim de 21 de zile, iar apoi se duce PROIS-reducere, și cu titrul CSA 30-35 zile ajunge la zero. RAC a acceptat mi-a pus Todd în micro- și macrovolumes.
HAI. Pune pe procedura standard utilizată pentru laboratoarele de diagnostic) cal virologice. Flacoane din sticlă aplicate și convenționale sau volume de reactiv panouri din plastic de unică folosință cu găuri și microvolumes de reactivi. Pentru reacția post-Novki folosind grup eritrocite umane celule sanguine roșii O, sau cobai. Serul de testat este tratat cu caolin și masa de celule roșii (acesta din urmă - atunci când se utilizează eritrocite umane). Toate diluțiile sunt preparate în ser fiziologic p-D suplimentat cu 0,04% albumină serică RNC.
Indirect IF, RN, radioimunotest prezentat de conventionale Meth-todikam.
Diagnosticul diferențial. RVI vițeilor nou-născuți ar trebui să fie diferențierea împăcării de infectie coronavirus, colibaciloză. Este necesar să se excludă dispepsie vițeilor nou-născuți origine nutrițională. Pentru titrare a virusului din grupa A dezvoltat metode și dot blot hibridizare ARN cu sonde pentru segmentul de ADN genomic 4, obținut prin amplificare PCR giperdivergentnyh zonele genei proteinei VR4 (nucleotidele 211-686) la piesa de ADN. IR, IND, CNVF și Cr folosind primeri oligonucleotidici. 3 sonde tip specific (VR4) și nu reacționează încrucișat cu un ARN cu 2 catene R-tipuri RV heterolog.