virusurile issledovaniyapri de laborator care poartă identificarea și diagnosticul infecțiilor virale cuprind următoarele etape: izolarea, cultivarea, indicația (identificare), și identificarea virusurilor.
2.3.1 Cultivarea virusurilor
Virusurile nu cresc pe medii artificiale, și de a reproduce numai intracelulară. O realizare importantă a fost propunerea R. Gudpaschura în 1932 utilizate pentru cultivarea embrionilor de pui viruși. Cultivarea decizia finală a problemei virușilor a fost posibilă numai după metodele de bază de cultivare a celulelor în afara corpului au fost dezvoltate.
Utilizarea de embrioni de pui. embrioni de pui - aproape modele ideale, care nu sunt pentru cultivarea de virusuri (cum ar fi gripa si rujeola). O cavitate închisă previne microorganismele embrio-Novena penetrate din exterior, precum și dezvoltarea infecțiilor virale spontane. Embrionii utilizate pentru izolarea virusului primare din materialul patologic; pentru passirova-TION și salvarea lor, precum și pentru a obține cantitățile necesare de virus. Unele excitaton-Incorporarea (de exemplu, virusuri herpes) determina modificări caracteristice (acestea pot fi utilizate detectarea bolii TVA).
Pentru infecție folosesc de obicei embrioni de pui 7-12 zile. Înainte de provocarea, viabilitatea embrionului prin lustruirii (vizualizare în lumina transmisă). Condiții de viață a embrionilor în timpul lustruirii activității locomotoare care prezintă, model vascular vizibil. creion simplu delimita limitele camerei de aer.
embrioni de pui inoculate cu un material care conține virusul în condiții aseptice, cu instrumente sterile, pre-procesarea învelișului spațiului aerian cu iod și alcool. Infecția se realizează pe membrana-chorio alantoamniotic, cavitatea amniotică sau alantoidiană, sau în sac vitelin (Figura 29). Alegerea metodei depinde de infectarea proprietăților biologice ale virusului.
Figura 29 - Schema desen tensiune a embrionului pui in curs de dezvoltare
Cultura de celule. La început a fost metoda de supraviețuire a țesutului. El consta în faptul că vasul care conține mediul nutritiv, a adus o bucată de pânză. Celulele unor țesuturi, în aceste condiții pot supraviețui cuva (dar nu reproduce) până la 30 de zile, iar virusul se poate multiplica în ele. Totuși, această metodă a produs un randament foarte scăzut de virus. A fost necesar să se dezvolte condiția, ar fi liber de a reproduce la care celulele tesutului.
Pentru culturile de celule au fost req-Dimo rezolva patru probleme principale:
- să primească o cantitate dorită de liber (adică, izolate una de alta ..) Celule;
- pentru a crea astfel de medii și condițiile în care celulele pot prolifera în mod activ de cultură;
- să se asigure că condițiile în care culturile de celule nu au putut reproduce bacterii;
- să identifice metodele prin care să recunoască creșterea virusului în cultură de celule și să-l identificăm.
Pentru a izola izolat (separat), dar de celule viabile din țesutul deteriorat a început să folosească procesarea o soluție slabă de punți intercelulare tripsin degradează precise. Pentru celula cultivare diferite medii au fost propuse, care cuprinde toate cele necesare pentru nutrienți multiplicare celulară (aminoacizi, baze, vitamine, etc.), săruri minerale, având un pH optim etc. G. Pentru indicatorul adăugat mediu de cultură a căror schimbare de culoare poate fi judecat metabolismului celular și va multiplica-SRI. Sa constatat că, ca bază pe care celulele se multiplica si formeaza un monostrat pot fi utilizate tuburi și flacoane din sticlă de testare tratate bine. Pentru a suprima posibila creștere bacteriană a materialului care conține virusul înainte de semănat ea în cultura de celule antibiotice GRAIN Steel Pipeline.
In 1949, George. Enders, T. Weller si Frederick Robbins a aratat ca virusul polio se multiplica bine in culturi celulare tripsinizate primare derivate din rinichi de maimuță. Principalul dezavantaj al celulelor tripsinizate primare constă în faptul că, după câteva pasaje ele încetează să prolifereze. Prin urmare, o preferință a început să se bucure de cultura unor astfel de celule, care sunt capabile de a prolifera in vitro, pe termen nelimitat. Astfel de culturi de celule transplantate (linii de celule sunt caracterizate prin nemurire și cariotipului heteroploid) obținute din țesutul tumoral (HeLa derivată de la carcinomul de col uterin, Hep-2 - de la carcinom laringian; Detroit 6 - metastazei cancerului pulmonar la maduva osoasa; RH - tumora rinichi uman) sau a celulelor mutante cu set poliploide de cromozomi. Cu toate acestea, celulele tumorale nu pot fi utilizate pentru producerea de vaccinuri. În acest scop, sunt utilizate numai acele culturi de celule, care nu conțin viruși și nu au kontaminantnyh malignitate. Cel mai bine este de a satisface aceste cerințe celule diploide.
Poluperevivaemye (diploid) culturi celulare - celulele un genotip capabil sa reziste in vitro, 50-100 treceri, menținând în același timp setul său original diploid de cromozomi. Liniile de fibroblaste embrionare umane diploide sunt utilizate atât pentru diagnosticul infecțiilor virale și în producția de vaccinuri virale. După cum sa dovedit, virusurile pot fi propagate nu numai în celule cultivate, formând un monostrat pe tubul de sticlă, dar într-o suspensie de celule vii.
Pentru o creștere de susținere a vieții mass-media nevoie de celule cultivate. Prin programare, acestea sunt împărțite asupra creșterii și sprijin. Mediile de creștere de nutrienți trebuie să conțină mai multe elemente nutritive care furnizează proliferarea activă a celulelor și formarea unui monostrat. medii de susținere oferă o experiență deja în monostratul de celule format în timpul de reproducere a unui virus.
Izolarea virusului 2.3.2
Izolarea virusului în culturi celulare. La alocarea virusurilor din diferite materiale infecțioase (sânge, urină, secreții de mucus, tampoane de organe) folosite culturi de celule cu cea mai mare sensibilitate la virusul intenționat. Pentru infecție folosind culturi în eprubete cu un bine dezvoltat cu un monostrat de celule. Înainte de infectare mediul de cultură a fost îndepărtat și celulele din fiecare tub este fabricat din 0,1-0,2 ml de suspensie a materialului pretratate cu antibiotice pentru a ucide bacteriile și ciupercile. După 30-60 minute de contact a virusului cu monostratul de celule a elimina excesul de material introdus în mediul de cultură de întreținere, iar proba este lăsat în cuptor până semne de replicare a virusului.
Izolarea virusului la animalele de laborator. Dacă este imposibil să se izoleze și identificarea virusului in vitro prin metode standard materiale infecțioase administrate animalelor sensibile la agentul patogen, și după dezvoltarea procesului infecțios tipic se realizează culturi de celule sensibile la reinfectare. folosesc cel mai adesea șoareci, iepuri și maimuțe; pentru a evidenția unele virusuri (cum ar fi virusurile Coxsackie) infectează șoarecii iziți. Din cauza costurilor ridicate și complexitatea animalului de laborator, aproape peste tot au fost înlocuite cu cultura-adeziv exacte. Cu toate acestea, modele animale folosite pentru a studia în mod activ, în special patogeneza stey și formarea răspunsurilor imune la infecțiile virale.
Astfel, pentru izolarea culturilor pure de virusuri in vitro Următoarele obiecte vii aflate în prezent în uz (model biologic): 1) culturi de celule (tesuturi, organe); 2) embrioni de pui; 3) animalele de laborator.
2.3.3 Indicarea virusurilor
Indicarea virusului in embrion de pui. Indicarea virusului in embrionat produs de moartea embrionară alantoidian pozitiv hemaglutinării sticla sau lichid amniotic pentru formarea leziunilor focale ( „plăci“) pe membrana chorio alantoidian.
Indicarea virusurilor în culturi celulare. Indicator al prezenței virusului în culturile de celule infectate pot fi:
1) Dezvoltarea degenerarea celulelor specifice - efectul citopatic viral (CPE), are trei tipuri principale: sau degenerarea largă celule mici; formarea de celule gigante multinucleate (symplast); dezvoltarea leziunilor proliferative celulare, constând din mai multe straturi de celule (de degenerare a celulelor acinare).
Există două mecanisme de moartea celulelor cauzate de virusuri - necroza și apoptoza. Necroza apare din cauza deteriorării ireversibile a integrității membranei celulare, apoptoza - fragmentarea ADN-ului nuclear datorită acțiunii endonucleazică celulare.
culturi celulare microscopie effektyotsenivayut citopatic. Prin gradul de deteriorare de celule este virusurile izolate cu citopatic ridicată sau moderată:
2) detectarea incluziuni intracelulare. aranjate în citoplasmă și / sau în nucleele celulelor infectate;
3) o reacție pozitivă de hemaglutinare (WGA) sau gemadsorbtsii (RGAds). Unii viruși, cum ar fi virusul gripal, au un set-reteta speciala (hemaglutinina), prin care sunt adsorbite pe celulele roșii din sânge și provoacă aglutinarea lor (hemaglutinare). Aceste virusuri sunt ușor detectate prin hemaglutinarea sau gemadsorbtsii (eritrocite adsorbite pe infectate cu virus celulele Cul-tururi țesuturi);
4) placa fenomen. Răspândită propusă în 1952 prin analiza pe placă R. Dulbecco (colonii negativ), care permite cuantificarea virusurilor. Pentru celulele de izolare monostrat virus după îndepărtarea mediului de cultură inoculat cu material conținând virus și acoperite cu un strat de agar care conține indicator roșu neutru. Cupe (flacoane) au fost incubate la 37 ° C După un 48-96 h detectat pete - placa. Ei au un diametru de 1-3 mm și apar necolorate pe un fundal roz. Petele sunt datorate efectului citopatic al virusului;
5) Salk reacție de culoare. La creșterea virusului în celulele pot fi evaluate prin indicatorul adăugat la mediul de cultură. Dacă celulele au metabolism activ, pH-ul trece la partea acidă, iar mediul devine galben. În cazul propagării virusului, celulele sunt ucise, puținul pH variază, și acesta păstrează originalul (magenta) culoarea, sau (la pH neutru) devine portocalie;
6) reacția de interferență (utilizat în absența CPE, hemaglutinare și gemadsorbtsii) au studiat cultura infectate cu virusul care provoacă în mod repetat CPE. În cazul pozitiv DPC va fi absent (reacția interferență este pozitivă). În cazul în care materialul de testare a virusului nu a fost observat CPP.
In plus, pentru detectarea diferitelor teste serologice de virus pot fi folosite în culturi celulare.
Indicarea virusurilor la animalele de laborator. Indicarea bazată pe detectarea virusului la animale semne de boli infecțioase, înregistrarea deceselor lor, studiul naturii patologiei și histopatologice în țesuturi și organe, identificarea hemaglutinare pozitive.
2.3.4 Metode de identificare a virusurilor
Determinarea tipului de virus (identificarea acestuia) se bazează pe neutralizarea activității biologice a virusului-IFPS folosind antiseruri specifice acestui tip. Rezultatul final poate fi stabilit pe baza următoarelor caracteristici:
1) neutralizarea efectului citopatic. în mediu de cultură care conține virusul în studiu, ceea ce face ser comercial (de exemplu virusul rubeolei bănuit), incubat și infecta o a doua cultură; 1-2 zile pentru a face cunoscut virus citopatogen. În prezența efectului citopatic concluziona că prima cultură a fost infectat cu un virus, corespund anticorpilor folosind seruri;
2) neutralizarea gemadsorbtsii de reacție;
3) schimbarea culorii de afișare a eșantionului;
4) întârzierea (frânare) reacția de hemaglutinare. mediu de cultură amestecat cu un holding-patogen cu un antiser comercial cunoscut și contribuie la cultura celulară. După incubare, capacitatea culturii la hemaglutinare, iar în absența acestuia face concluzia neconformității antiserului virusului.
5) neutralizarea în experimentele pe animale.
Astfel, RN (reacție de neutralizare), bazată pe reprimarea reacțiilor respective, fenomenul procesului infecțios după efectuarea unei culturi sau administrarea la un animal cu un amestec de virus-spe fichnymi AT, conținute în ser de diagnosticare.
Întrebări pentru auto-control
1 Care sunt principiile de bază ale clasificării virusului.
2 Adu români și latine numele principalelor familii de viruși de oameni și animale.
3 Care sunt tipice reprezentanți ai familiilor majore ale virusurilor și a bolilor cauzate de acestea.
4 Care sunt caracteristicile morfologia și ultrastructura virusurilor umane și animale (familii principale)?
5 Denumire ARN genomic și virusurile ADN genomic de plante.
6 Ce măsuri includ teste de laborator pentru identificarea virusurilor și diagnosticul infecțiilor virale?
7 Care sunt modelul biologic utilizat pentru izolarea și cultivarea de virusuri umane si animale?
8 Cum este infectarea a embrionilor de pui în laborator?
9 Care sunt metodele de obținere a culturii de celule, știi?
10 Cum să efectueze identificarea virusului in embrioni de pui și la animalele de laborator?
11 Care sunt metodele de viruși de afișare în cultură celulară?
12 Care este scopul și natura reacțiilor de neutralizare a virușilor?
13 Care sunt modalitățile de a neutraliza viruși care stabilesc reacții.