Determinarea structurii primare a proteinelor
Determinarea structurii primare a proteinei trebuie să fie servit o serie de operații preliminare. Proteina trebuie să fie bine curățate, puritatea materialului trebuie confirmată prin cel puțin două metode independente. Cel mai adesea ispolzetsya electroforeză pe gel pe poliacrilamidă (PAGE) și ultracentrifugare. După purificarea proteinei este împărțită în două sau trei sau mai multe părți. Fiecare porțiune a fost tratată cu diferite enzime u proteinaze (tripsina, chimotripsina) sau reactiv (bromură de cianogen, acidul iodosobenzoic). Rezultatul este un două sau trei (sau mai multe) seturi de polipeptide (segmente de proteine). cerințe speciale proteinaza K fermentam- sunt făcute curățenie, altfel va fi dificil determinarea ulterioară a secvenței de alternare a segmentelor de peptide native din lanțul proteic. Deosebit de dificultate este recunoașterea locurilor de punți disulfurice între resturile de cisteină. Amestecul de peptide rezultat separat prin electroforeză, atunci este posibil pentru a începe procedura de direct sevenirovaniya. peptidă singură nu trebuie să depășească 40 de arme AK-reziduuri.
Metoda cea mai frecvent utilizate secventiere peptide (resturile AA secvențiere în aceasta) este procedura de P. Edman. folosind fenilizotiocianat (FITC). Procedura este baza secvențiatoare automate. proba de peptidă purificată a fost aplicată pe suprafața vasului de reacție sub forma unui film. De multe ori, de cusut se realizează peptida covalente cu capătul liber al grupărilor COOH cu materialul din vasul de reacție. Apoi a efectuat o serie de cicluri repetitive de reacții. O serie de reacții includ:
- reacția cu reziduu AA-FITC terminală având un NH2 liber -în, formând un FT K. (feniltiokarbamoil) derivat așa-numitul:
- FITC în exces este îndepărtat, schimbarea pH-ului prin adăugarea de acid heptafluorbutiric, în care conversia are loc în FTC PTH (feniltiogidantoin) derivat:
- derivat al acidului PTH-amino este îndepărtată din mediul de reacție prin extracție cu 1-clorbutan și seria de reacții se repetă în ciclul următor.
Pe parcursul unui ciclu îndepărtat un rest de aminoacid al peptidei NH2-margine. Deoarece reacția cu FITC nu a procedat cantitativ, iar cel mai bun 95 de procente, se acumulează treptat factor de interferență N- PTH derivați ai nereacționat în ciclurile anterioare reziduurile AK. În cele mai favorabile cazuri, este posibil să se identifice în mod fiabil secvența de doar aproximativ 40 de arme AK-reziduuri. Cu toate acestea, ca urmare a procesului de automatizare, locul de muncă este încă mult mai ușor.
DEFALCARE PRIN peptidazei:
a) resturile N-terminale care utilizează aminopeptidaza (identificarea și cinetica acumulării AA corespunzătoare cromatografice.
b) terminația C folosind carboxipeptidaze (similar).
Hidrazinoliza (în condiții anhidre, la 100 ° C), cu excepția ultimului reziduu cu COOH liber, toate transformate în acizi hidrazide:
Ordinea peptidelor în moleculele proteice se determină prin suprapunerea fragmentelor de peptide:
G-W-V-RA-O-V-KC-E-C-D peptide triptice (tripsină)
G-WV-R-A-OV-K-C-E-C-D peptide himotripticheskie (chimotripsina)
Bibliografie:
1. Build EA Biological Chemistry. M. 1986.
2. Strayer L. Biochimie, 3 Vols. Mir 1984.
3. alb, Handler. Smith și colab., Biochimia Fundamentals 3 Vols. Mir 1981.
4. YA Ovchinnikov chimie Bioorganic, M. Educație 1987.
5. Anisimov și colab., Biochemistry Fundamentals. M. Școala Superioară din 1986.