Scopul studiilor microbiologice este de a stabili prezența sau absența unui agent în corpul pacientului și în obiectele de mediu.
Sarcini studii microbiologice - identificarea microorganismelor în material, pentru a determina originea lor specii, proprietăți morfologice, biochimice și antigenice toxigene, și de a stabili sensibilitatea microorganismelor izolate la agenți antimicrobieni. În ciuda faptului că cercetarea microbiologică este responsabilitatea microbiologi, fiecare medic care se ocupă cu boli infecțioase, ar trebui să știe cum și când este necesar pentru a selecta materialul de cercetare, pe care ghidul său de studiu și de modul de interpretare a rezultatelor.
Prima etapă a oricărui studiu microbiologic este alegerea corectă a materialului pentru studiu. Este determinată de proprietățile agentului patogen și de patogeneza bolii cauzate de acesta. Cu leziuni ale organelor și sistemelor individuale, este de preferat să selectați materialul localizării corespunzătoare. În absența leziunilor, sângele este examinat și apoi probele sunt luate ținând cont de imaginea clinică a bolii și de disponibilitatea materialului pentru studiu. Deci, cu o febră de origine necunoscută, sângele este inițial semănat; atunci când apar simptome de manifestări mai specifice, cum ar fi pneumonia, apare sputa.
• Probele trebuie colectate înainte de numirea terapiei antimicrobiene, în conformitate cu normele aseptice pentru a preveni contaminarea materialului. Fiecare eșantion ar trebui considerat ca fiind potențial periculos. La colectarea, transportul, depozitarea și lucrul cu acesta este necesar să se respecte normele de siguranță biologică. Materialul este colectat într-un volum suficient pentru întregul complex de studii. Studiile microbiologice trebuie să înceapă imediat după ce eșantionul este luat în laborator.
• Alegerea materialului pentru studiu ar trebui să fie în concordanță cu natura procesului infecțios. De exemplu, în stabilirea etiologiei pneumoniei, materialul ar trebui să fie spută, nu saliva, și cu infecții la nivelul plăgilor, detașabilul ar trebui să fie luat din adâncul plăgii și nu din suprafața acesteia.
Alegerea studiilor de laborator
Baza de diagnostic microbiologic al bolilor infecțioase este metoda microscopică, microbiologică, biologică, serologică și alergică.
Metodele microscopice includ prepararea de frotiuri și preparate pentru microscopie. In cele mai multe cazuri microscopice constatări sunt orientative (de exemplu, pentru a determina raportul dintre agenți de colorare), cât mai multe microorganisme lipsit tinctoriale și caracteristici morfologice. Cu toate acestea, materialul poate fi determinată prin microscopie, unele caracteristici morfologice ale agenților patogeni (prezența, flageli, incluziuni intracelulare, etc.), și, de asemenea, pentru a stabili prezența sau absența microorganismelor în probele trimise.
Metodele microbiologice sunt "standardul de aur" al diagnosticării microbiologice, deoarece rezultatele studiilor microbiologice permit identificarea prezenței unui agent în materialul studiat. Identificarea culturilor pure (până la speciile de microorganisme) se efectuează ținând cont de proprietățile morfologice, tinctinare, culturale, biochimice, toxigenice și antigenice ale microorganismului. Majoritatea studiilor includ determinarea sensibilității la agenți antimicrobieni în agentul patogen izolat. Pentru evaluarea epidemiologică a rolului microorganismului, identificarea intraspecifică se realizează prin definirea fagului, a biovarelor, a substanțelor de rezistență etc.
Metodele biologice sunt direcționate spre determinarea prezenței agentului patogen în materialul de toxine și detectarea agentului patogen (in special cu un conținut inițial mic în probă). Metodele includ infectarea animalelor de laborator cu material de testat, urmată de izolarea unei culturi pure a unui agent patogen sau constatarea prezenței toxinei microbiene și natura sa. infecții experimentale de simulare la animalele sensibile - un important instrument pentru studierea patogeneza bolii și natura interacțiunilor în cadrul sistemului de microorganisme macro-organism. Pentru a efectua eșantioane biologice, se utilizează numai animale sănătoase cu o anumită greutate corporală și vârstă. Material de infectare este introdus în interiorul căilor respiratorii, intraperitoneal, intravenos, intramuscular, intradermic și subcutanat în camera anterioară a ochiului, o gaură bavuri prin craniu, suboccipital (într-un mare creier rezervor). Animalele iau sange in vivo, exudatele din peritoneu, după moarte - sânge, bucăți de diferite organe, LCR, exudat din diferite cavități.
Metodele serologice pentru detectarea agenților patogeni specifici AT și AG sunt un instrument important în diagnosticarea bolilor infecțioase. Aceștia au o valoare specială în acele cazuri în care nu este posibil să se izoleze agentul patogen. Astfel, este necesară identificarea titruri crescânde AT, și seruri, prin urmare, probele testate au împerecheat luate în intervalul de 10-20 zile (uneori acest interval poate fi mai lung). AT apar, de obicei, în sânge timp de 1-2 săptămâni de boală și circulă în organism timp îndelungat, ceea ce face posibilă utilizarea detecției lor pentru studii retrospective epidemiologice. Definiția clasei Ig caracterizează clar etapele procesului infecțios și poate servi și ca un criteriu de prognostic indirect. O importanță deosebită sunt metodele de detectare a Ag microbian. În cifre semnificative, ele apar în cel mai scurt calendarul, ceea ce le face un instrument important pentru identificarea rapida a diagnosticului bolilor infecțioase și definiția lor cantitativă furnizează o măsură a eficacității terapiei antimicrobiene în dinamica procesului infecțios.
Metode alergologice. Ag de mulți agenți patogeni are un efect sensibilizant care este utilizat pentru diagnosticarea bolilor infecțioase, precum și pentru efectuarea de studii epidemiologice. Cele mai frecvente sunt testele alergice la nivelul pielii, inclusiv administrarea intradermică de Ar (alergen) cu dezvoltarea reacției de HRT. Testele cutanate au fost utilizate în diagnosticul bolilor precum sapa, melioidoza, bruceloza. Cel mai cunoscut este Mant Pro, folosit atât pentru diagnosticul de tuberculoză, cât și pentru evaluarea imunității organismului la agentul patogen.
Metode de izolare și identificare a bacteriilor
Această secțiune cuprinde următoarele subiecte: pregătirea materialelor pentru microscopie si tipuri de microscopie, medii de cultură pentru cultivarea bacteriilor, plantarea și cultivarea bacteriilor pentru a studia caracteristicile creșterii bacteriene pentru identificarea lor primare, precum și biochimice, serologice, metodele alergologice și biologice pentru identificarea bacteriilor.
Orice studiu bacteriologic începe cu microscopia materialului și însămânțarea ulterioară a acestuia pe suporturi nutritive. Eficacitatea excreției excretorilor se datorează în mare măsură tehnicii corecte de prelevare a probelor de material clinic, termenului de livrare a acestora la laborator și stocării corespunzătoare a probelor.
Pentru microscopia ușoară se utilizează un microscop, un dispozitiv optic care permite observarea obiectelor mici (Fig.11-1). Imaginea este mărită de lentila condensatorului, obiectivul și ocularul. Un condensator situat între sursa de lumină și obiectul studiat colectează raze de lumină în câmpul unui microscop. Obiectivul creează o imagine a câmpului microscopului din interiorul tubului. Ocularul mărește această imagine și face posibilă percepția acesteia cu ochiul. Limita de rezoluție a microscopului (distanța minimă la care se disting două obiecte) este determinată de lungimea undei luminoase și de deschiderea lentilelor. Teoretic, posibila rezoluție a microscopului de lumină este de 0,2 μm; Rezoluția reală poate fi mărită prin mărirea diafragmei sistemului optic, de exemplu prin creșterea indexului de refracție. Indicele de refracție (imersie) lichide mai mare decât coeficientul de refracție al aerului (n = 1,0), când microscopul este utilizat de mai multe fluide de imersie: ulei, glicerină, apă. Partea mecanică a microscopului include un șurub trepied, un șurub, un macro și un micrometru, un tub, un suport pentru tuburi.
Figura 11-01
Microscopia Darkfield face posibilă observarea bacteriilor vii. Pentru aceasta, se folosește un condensator de câmp întunecat, care separă structurile contrastante ale materialului nevopsit. Înainte de a începe lucrul, lumina este reglată și centrată pe un câmp luminos, iar apoi condensatorul de lumină este îndepărtat și înlocuit cu un sistem adecvat (de exemplu, "OI-10" sau "OI-21"). Preparatul se prepară folosind metoda "drop drop", făcând-o cât mai subțire posibilă (grosimea geamului de acoperire nu trebuie să fie mai groasă decât 1 mm). Obiectul observat arată ca luminat într-un câmp întunecat. În acest caz, razele de iluminat cad pe obiect din lateral și numai razele împrăștiate intră în lentilele microscopului (fig.11-2). Ca lichid de imersie, uleiul de vaselină este potrivit.
Figura 11-02
Fig. 11 -2. Schema unui microscop cu lumină cu condensator de câmp închis. Explicații în text.
Phase-contrast microscopy vă permite să studieze obiecte vii și nevopsit prin creșterea contrastului lor. Când lumina trece printr-un obiect colorat este o schimbare a amplitudinii undei luminii, iar la trecerea prin nevopsită - faza de lumină val care este folosit pentru a obține imagini cu contrast ridicat în contrast de fază (Figura 11 -3.) Și microscopia interferență. Pentru a mări contrastul, inelele de fază sunt acoperite cu un metal care absoarbe lumina directă, fără a afecta schimbarea de fază. În sistemul optic al microscopului este utilizat un condensator special cu un revolver cu diafragmă și un dispozitiv de centrare; lentilele sunt înlocuite cu obiective de imersie - apochromați.
Figura 11-03
Polarizarea microscopică face posibilă obținerea de imagini ale structurilor anisotropice nevopsite (de exemplu, fibre de colagen, miofirili sau celule microbiene). Principiul metodei se bazează pe studiul unui obiect în lumina formată din două fascicule, polarizate în planuri reciproc perpendiculare.
Interferența microscopie combină principiile de contrast de fază și microscopie de polarizare. Metoda este folosită pentru obținerea unei imagini tridimensionale contrastante a obiectelor nevopsite. Principiul metodei se bazează pe bifurcația fluxului de lumină într-un microscop; un fascicul trece prin obiect, celălalt - trecut de el. Ambele raze sunt conectate în ocular și interferează unul cu celălalt.
Luminescent microscopie. Metoda se bazează pe capacitatea anumitor substanțe de a straluci sub acțiunea radiațiilor de undă scurtă. În acest caz, undele luminoase emise sunt mai lungi decât valul care provoacă strălucirea. Cu alte cuvinte, obiectele fluorescente absorb lumina unei lungimi de unda si radiaza in alta regiune a spectrului (Figura 11-4). De exemplu, dacă radiația inductivă este albastră, atunci strălucirea rezultată poate fi roșie sau galbenă. Aceste substanțe (izocianat de fluoresceină, portocaliu acridina, rodamina, etc.) sunt utilizate ca vopsele fluorescente pentru observarea fluorescente (luminiscentă) obiecte. Într-un microscop fluorescent, lumina dintr-o sursă (lampă cu mercur de presiune ultrahigh) trece prin două filtre. Primul filtru (albastru) întârzie lumina din fața probei și transmite lumina cu lungimea de undă care excită fluorescența probei. Al doilea (galben) întârzie lumina albastră, dar pierde lumina galbenă, roșie, verde emisă de obiectul fluorescent și percepută de ochi. De obicei, microorganismele aflate în studiu sunt colorate direct sau cu ajutorul AT sau lectinelor marcate cu fluorochromi. Preparatele interacționează cu structurile de legare ale ligandului sau ale altor obiecte ale ligandului. microscopie Fluorescenta a fost utilizat pe scară largă pentru a vizualiza rezultatele reacțiilor imunochimice, bazate pe interacțiunea specifică a anticorpilor marcați cu coloranți fluorescent Ar obiect în studiu. Variantele de reacții imunofluorescente sunt prezentate în Fig. 11-5 și 11-6.
Figura 11-04.
STILL Figura 11-05
Fig. 11 -5. Imunofluorescență directă. O metodă directă implică utilizarea colorantului fluorescent marcat AT la Ar; AT interacționează cu Ar în locațiile localizării, ceea ce vă permite să vizualizați eticheta.
Figura 11-06.
Fig. 11 -6. Imunofluorescență indirectă. O metodă indirectă implică utilizarea a două AT-uri diferite. Primele AT-uri reacționează cu Ar al microorganismului, cele două AT-uri (legate de etichetă) interacționează în mod specific cu primele AT care sunt Ar la cel de-al doilea AT. Metoda este mult mai sensibilă decât imunofluorescența directă, deoarece mai multe molecule din al doilea AT se leagă la fiecare moleculă a primului AT.
Teoretic, rezoluția microscopului electronic de transmisie este de 0,002 nm; Rezoluția reală a microscoapelor moderne se apropie de 0,1 nm. În practică, rezoluția pentru obiectele biologice ajunge la 2 nm.
Microscopul cu transmisie electronică (figurile 11-7) constă dintr-o coloană prin care electronii trec într-un vid emis de filamentul catodic. Un fascicul de electroni, focalizat pe magneți inelari, trece printr-o probă pregătită. Natura împrăștierii electronilor depinde de densitatea probei. Electronii care trec prin eșantion se observă pe un ecran fluorescent și se înregistrează cu o placă fotografică.
Microscopul electronic de scanare este utilizat pentru a obține o imagine tridimensională a suprafeței obiectului studiat.
FURNIZAREA Figura 11-07.
Pregătirea materialului pentru microscopie
Practica bacteriologic examina microscopic eșantioane necolorate (material nativ) și preparate colorate (frotiuri sau pete) preparate din probe clinice și colonii de microorganisme cultivate.
Medicamentele native sunt pregătite pentru studiul bacteriilor vii nevopsite. Metoda de picătură suspendată a fost cea mai utilizată. microcamere cu medii dense și metode negative pentru studierea bacteriilor vii. Pentru cercetarea intravitală, se folosesc adesea microscopie cu câmp închis și cu contrast de fază. Astfel de tehnici sunt adesea folosite pentru a diagnostica sifilisul și pre-diagnosticarea diareei provocate de campylobacter și pentru a determina mobilitatea microorganismelor.