O caracteristică distinctivă a biotehnologiei este principiul aseptic (sterilitate), care rezolvă următoarele probleme:
1) eliminarea microflorei străine din soluții înainte de introducerea semințelor în acestea;
2) menținerea purității culturii pe tot parcursul procesului de creștere;
3) sterilizarea mediilor nutritive, a componentelor suplimentare, a titranților, a agenților de îndepărtare a defoamelor;
4) sterilizarea aerului de alimentare.
Principalele metode de sterilizare utilizate în producția biotehnologică sunt prezentate în tabelul 1.
Cele mai importante sunt metodele termice pentru sterilizarea echipamentelor și mediilor, precum și filtrarea - pentru a elimina microorganismele din aerul introdus în bioreactor sau în alt gaz. De regulă, pentru sterilizarea mediilor și a echipamentelor se utilizează tratarea termică umedă folosind apă și abur. Acest tratament este mai eficient decât încălzirea bioreactorului uscat. Cel mai adesea se utilizează sterilizarea cu abur supraîncălzit, injectat direct în aparat sau generat în bioreactorul însuși. Dacă mediul conține proteine, în acest caz reactorul este sterilizat separat, pentru a evita arderea substanțelor conținute în mediul nutritiv pe încălzitorul electric.
Metode de sterilizare utilizate în biotehnologia industrială
Este necesar să se găsească temperatura optimă la care se obține o fiabilitate ridicată a sterilizării și, în același timp, costurile de energie și pagubele materiale sunt reduse la minimum. Încălzirea poate provoca transformări chimice ale componentelor mediului nutritiv. La 100 ° C și mai sus, grupările carbonil ale zaharurilor interacționează cu ionii de amoniu sau cu grupele amino ale aminoacizilor și proteinelor. În acest caz, se formează produse care inhibă creșterea celulelor. Pentru a evita acest lucru, este necesar să se sterilizeze separat mediul nutritiv.
Descompunerea anumitor substanțe, de exemplu, monozaharide și vitamine, forțează limitarea timpului și a temperaturii pentru sterilizarea termică și, uneori, o abandonează complet. Prin urmare, se utilizează dezinfectanți chimici sau filtrarea lichidelor. Filtrele sunt însă înfundate rapid de celulele microorganisme și alte particule în suspensie.
În producția de tonaj mare, substraturile nutritive sunt sterilizate printr-o metodă periodică și continuă. Cu o metodă în șarjă, sterilizarea se efectuează într-un fermentator. Mediul este încălzit până la temperatura de sterilizare (128-135 ° C), menținut la această temperatură timp de 20-30 minute și răcit la temperatura de fermentație. Din punct de vedere economic mai profitabil este metoda continuă de sterilizare. Încălzirea mediului se efectuează în coloane, ejectori de abur, schimbătoare de căldură. Durata întreținerii mediului trebuie să garanteze inactivarea celulelor și sporilor vegetativi.
În laborator se utilizează metode termice pentru sterilizarea echipamentelor și a mediilor nutritive: autoclavare, fierbere, pasteurizare, calcinare.
Calcinarea. flashbirovaniem sau sterilizate folosi doar inainte de bucle bacteriologice și ace, cuțite, obiecte metalice mici (foarfeci, pensete) și tijele de sticlă, sub rezerva. coverslips.
Sterilizarea cu căldură uscată este utilizată pentru tratarea vesela și a materialelor uscate, de exemplu, cretă, amidon. Încălzirea se efectuează timp de 2 ore la 170 ° C în dulapuri uscate sau electrice de uscare. Temperatura de peste 170 ° C nu este recomandată: dopurile de bumbac și hârtia încep să se descompună. La sfârșitul sterilizării, carcasa este deschisă numai după ce temperatura din ea a scăzut la temperatura camerei, altfel sticla se poate sparge sub acțiunea aerului rece.
Sterilizarea cu un abur curgator (100 ° C) trateaza obiecte care se deterioreaza din caldura uscata si unele materiale nutritive care nu pot suporta o temperatura mai mare (mediu cu carbohidrati, lapte). Această sterilizare se numește fracționată și se produce timp de trei zile (30 de minute pe zi) într-un reboiler Koch sau într-o baie de apă. Cu o singură încălzire la o temperatură de 100 ° C, celulele vegetative mor în 30 de minute, sporii de microorganisme rămân viabili. După încălzire, mediul este plasat timp de 24 de ore într-un termostat la 28-30 ° C. Sporii, conservați la prima încălzire, au timp să germineze în forme vegetative în acest timp, care mor cu încălzire ulterioară. Operația se repetă de trei ori.
Sterilizarea cu abur saturat sub presiune este cea mai rapidă și cea mai fiabilă metodă de sterilizare termică, în care mor sporii cei mai stabili. Astfel, cele mai multe medii nutritive sunt sterilizate. Această metodă se bazează pe încălzirea substratului cu abur saturat la o presiune mai mare decât presiunea atmosferică. Tratarea cu abur în stare saturată se efectuează într-un cazan etanș, etanșat cu pereți groși, autoclavă. Autoclavul este un aparat metalic cu pereți dubli (figura 2), partea interioară a acestuia funcționează ca o cameră de sterilizare (1), în care este plasat materialul sterilizat.
Fig.2. Schema de autoclavă. 1 - cameră de sterilizare; 2 - robinet pentru priza de aer; 3 - manometru; 4 - supapa de siguranță; 5 - camera de vapori de apă; 6 - pâlnie pentru umplerea autoclavului cu apă; 7 - o gaură pentru intrarea aburului în camera de sterilizare; 8 - capacul autoclavului; 9 - suport pentru material sterilizabil.
Camera de sterilizare este prevăzută cu o macara (2) pentru orificiul de evacuare a aerului, un manometru (3) pentru determinarea presiunii de vapori și supapa de siguranță (4) pentru abur presiunea crește dincolo de ceea ce este necesar. Camera de apă (5) este umplută prin pâlnia (6) cu apă distilată până la marcajul de pe conducta de apă. Indicatorul de presiune arată cât de mult presiunea aburului din cazan este mai mare decât presiunea atmosferică. Indicatorii unui manometru în atmosferă fizică corespund unei anumite temperaturi. Fiecare microorganism are propriul său optim de temperatură. Sporii de microorganisme sunt mai rezistenți la temperatură și reprezintă factorul limitativ care determină regimul de temperatură al sterilizării medii.
Componentele mediilor nutritive reacționează diferit la efectele termice. Pentru a evita schimbările distructive nedorite, atunci când este posibil, se utilizează regimuri de sterilizare mai ușoare sau sterilizarea separată a componentelor.
Pasteurizarea este incompletă sau parțială, sterilizare, ceea ce înseamnă că încălzirea la 65-80ºS timp de 30 min, urmată de răcirea rapidă la 10-11ºS.
Sterilizarea prin filtrare prin filtre poroase fin este utilizată pentru tratarea mediilor ale căror componente se descompun ușor după încălzire. Prin porii mici ai filtrului se pot trece numai microorganisme mici (viruși, bacteriofagi).
Cele mai des folosite filtre sunt din cărbune, care sunt cilindri goi, închis pe o parte. Pentru ca lichidul să treacă printr-un astfel de filtru, este necesar să se creeze o diferență de presiune pe ambele părți ale cilindrului. Acest lucru se realizează prin forțarea sau evacuarea aerului cu ajutorul pompelor de ulei. Filtrul este conectat la un receptor pentru un mediu lichid - un balon Bunsen. Capătul tras al balonului este închis cu un dop de bumbac. Filtrul cu receptorul este sterilizat. Mediul pentru sterilizare este turnat într-un vas în care este plasat un filtru și balonul Bunsen cu un dop din cauciuc de bumbac este conectat la pompă și aerul este pompat. Lichidul sub presiune trece prin filtru în receptor. Bacteriile rămân în afara filtrului. Inconvenientele metodei constau în filtrarea lentă și în necesitatea curățării frecvente a filtrelor.
PROCEDURA DE LUCRU
1. Pregătiți un dop de tifon pentru a steriliza flaconul sau tubul de testare.
2. Pregătiți-vă pentru sterilizare (înveliți hârtie groasă) 4 feluri de mâncare Petri. Se pipetează și se înfășoară o bandă de hârtie.
3. Pregătiți un mediu nutritiv dens în conformitate cu metoda prescrisă de profesor.
4. Sterilizați mediul nutritiv pregătit într-o baie de apă în mod fracționat.
5. Se prepară o soluție sterilă de 0,89% de clorură de sodiu (soluție salină).
4. ECHIPAMENTE ȘI REACTIVE UTILIZATE ÎN PUNEREA ÎN APLICARE A LUCRĂRILOR DE LABORATOR: