bacteriofagi
Cu ajutorul vectorilor plasmidici este posibilă clonarea fragmentelor ADN de până la 10 t. Cu toate acestea, atunci când creați biblioteci genomice, adesea trebuie să lucrați cu fragmente mai mari. Pentru a face acest lucru, s-au dezvoltat vectori bazați pe bacteriofagul E. coli.
După intrarea în celulă, evenimentele se pot dezvolta în două scenarii. Când a implementat ciclul litic al fagului care începe să prolifereze rapid și după aproximativ 20 de minute, celula se prăbușește (liză) pentru a elibera până la 100 de noi particule de fag. Într-o variantă alternativă a ADN fagic în cromozomul evenimentelor incluse E. coli ca prophage în celulă și replicat împreună cu genele bacteriene normale (de stat lysogeny).
Cu toate acestea, datorită lipsei de nutrienți sau a altor circumstanțe nefavorabile, ADN-ul fag integrat este eliberat și se inițiază un ciclu de dezvoltare litice. Dimensiunea ADN a fagului l este de aproximativ 50 de tone. n. n. și o parte considerabilă a acesteia (aproximativ 20 de tone de inerție) nu are importanță pentru propagarea fagului și este responsabilă pentru integrarea sa în ADN gazdă. În acest sens, a apărut ideea că ar putea fi înlocuită cu un fragment de alt ADN de dimensiune echivalentă. Molecula recombinantă rezultată se va replica în celulă ca ADN al unui fag "recombinant" care a "crescut" pe calea dezvoltării.
Pentru a înțelege modul în care funcționează sistemul vectorial bazat pe fagi, este necesar să se ia în considerare aspectele moleculare ale ciclului de dezvoltare litice. Particula fagă infecțioasă are un cap în care este închis un ADN bine ambalat, cu o lungime de aproximativ 50 de tone. și procesul cu fibrele fine de proteine (fibrile) care o părăsesc. Asamblarea capului anexei și ambalarea ADN-ului sunt clar coordonate. ADN-ul fagului l este o moleculă liniară cu două lanțuri, cu o lungime de 50 de tone. cu cozi 5 "-" cu un singur lanț de 12 nucleotide. Acestea se numesc capete lipicioase (cos), deoarece sunt reciproc complementare și se pot împerechea între ele. După ce ADN-ul de fag trece prin proces și intră în E. coli, cos-capetele sunt conectate pentru a forma o moleculă inelară. În stadiul incipient al ciclului litice, ca urmare a replicării moleculei ADN circular, se formează o moleculă liniară, formată din mai multe segmente de lungime de 50 de tone.
Fiecare dintre aceste segmente este ambalat într-un cap de proteină, procesul deja asamblat se unește cu acesta din urmă și se formează o nouă particulă de fag. Atunci când se ambalează o moleculă de ADN cu o lungime mai mică de 38 de tone. se obține o particulă de fag neinfecțioasă și fragmente mai mari de 52 t. nu se încadrează în cap. Segmente de 50 t. într-o moleculă ADN liniară sunt separate de cos-site-uri, și este pentru aceste site-uri că molecula este tăiat atunci când segmentul următoare umple capul. Tăierea se face prin enzima localizată la intrarea în cap.
Ca urmare a studiilor privind studiul ansamblului de fagi, a fost elaborat un sistem de ambalare a moleculelor ADN in vitro cu formarea de particule de fag infectate. Amestecarea în tubul curățat de capete goale, ADN-ul fagului și procesele colectate, puteți obține particule de fagă infecțioase.
Sarcina cercetătorului este de a înlocui această regiune centrală cu o secvență nucleotidică de aproximativ 20 de tone în lungime. ADN-ul dorit. ADN-ul destinat clonării este, de asemenea, împărțit în fragmente care variază între 15 și 21 tone. Ambele preparate - fag și ADN străin - sunt combinate și se adaugă ligaza ADN. Fragmente de ADN cu o lungime de 50 de tone. Împachetate în cap, ele se alătură cu mugurii și se formează particule de fag infecțioase. Fragmente mai mari (> 52 tone l.) Sau mai puțin (<38 т. п. н.) размера упаковываться не могут.
Hibrid de plasmidă și fag. De fapt, este doar o plasmidă, care au site-uri de legare la proteine de înveliș a fagului (numite cos-uri, și-a luat numele deoarece cosmide). Carcasa proteică face ca cosmida să fie mai stabilă, astfel încât inserțiile mai lungi să poată fi încărcate în ea.
Vectorii, numiți cosmizi, pot include până la 40 de tone de n. ADN străin și, în același timp, este în mod activ amilirat în E. coli ca plasmide. Cosmidele combină proprietățile vectorilor plasmidici și vectorii bazați pe fagi. De exemplu, utilizat pe scară largă de cosmide PLFR-5 (aproximativ 6 m. N. N.) Are două cos situs de fagi situs de restricție separat, un polilinker cu șase situri unice de restricție, o origine a replicării ADN-ului (ori) și gena de rezistență la tetraciclină ( tc). Acest cosmid poate integra ADN străin cu o lungime de până la 40 de tone. Preparatele ADN sunt amestecate și ligate. Produsele de aliere care conțin o inserție cu o lungime de 40 de tone. au o dimensiune totală de aproape 50 de tone. și, prin urmare, pot fi ambalate in vitro în capete de fagi. Moleculele reasociate pLFR-5 care nu conțin inserții nu vor fi ambalate. După asamblarea particulelor de fag, ele infectează E. coli.
Odată ce se află într-o celulă bacteriană, o moleculă liniară cu o inserție se închide în inel datorită împerecherii cosurilor. Într-o astfel de configurație stabilă, ea poate exista pentru o lungă perioadă de timp în celulă și se repetă ca o plasmidă hibridă, deoarece conține toate elementele necesare pentru aceasta. În plus, gena rezistenței la tetraciclină asigură creșterea coloniilor care poartă acest cosmid. Cosmide au un mare avantaj în comparație cu plasmide: ele pot fi încorporate fragmente mai extinse, iar acest lucru înseamnă că aveți nevoie de mai puține clone și necesită mai puțin timp pentru a crea biblioteci genomice lor de screening.