Caracteristicile muncii într-un laborator steril
Când se lucrează într-o încăpere de laborator sterilă, toți angajații laboratorului bacteriologic trebuie să respecte următoarele reguli de lucru care asigură sterilitatea în muncă și împiedică posibilitatea infecțiilor intra-laborator:
1. Toate persoanele din laborator trebuie să poarte rochii, să schimbe pantofii (sau pantofii), un capac alb sau o batistă.
2. În cameră nu este permis să mănânce și să fumeze, să depoziteze alimente.
3. Nu poți aduce lucruri străine.
4. Este interzis să ieșiți în laborator în rochii sau să vă îmbrăcați într-o rochie superioară pe o haină.
5. Fiecare lucrător ar trebui să-și folosească locul de muncă numai.
6. Toate operațiunile trebuie efectuate în conformitate cu reglementările privind sterilitatea: toate lucrările sterile sunt efectuate în apropierea flăcării arzătorului, transfuzia de lichide contaminate se efectuează deasupra tăvii cu soluție dezinfectantă etc.
7. Trebuie să urmăm cu strictețe puritatea mâinilor: după terminarea lucrului cu materialul infecțios, acestea sunt dezinfectate. La sfârșitul zilei, locul de muncă este pus în ordine și dezinfectat complet.
8. Orice inventar care este în contact cu materialul infecțios trebuie să fie sterilizat sau distrus.
Laboratorul de biotehnologie trebuie păstrat curat. Trebuie să se efectueze o curățare igienică regulată a spațiilor de laborator. Asigurarea sterilității complete a laboratorului este foarte dificilă și nu este întotdeauna necesară, dar este posibilă reducerea semnificativă a numărului de microorganisme din aer și de pe diferite suprafețe din încăperile de laborator. Acest lucru se realizează prin utilizarea în practică a metodelor de dezinfecție, adică distrugerea agenților patogeni de boli infecțioase asupra obiectelor din mediul extern.
Pentru cultivarea răsadurilor sterile este necesar să se folosească cutii laminate, care asigură plantarea explantelor pe mediul nutritiv fără infectare cu microorganisme.
Toate suprafețele laminarului sunt prelucrate cu alcool 96%, scule sterilizate, materiale, materiale de plante sunt plasate pe masa laminară și includ radiații UV. După 20 de minute, UV-ul este oprit și biofiltrele sunt pornite. Pentru a lucra într-o cutie laminară, au pus pe o rochie sterilă și o pălărie, procesez 96% alcool cu mâinile mele. Pensetele, scalpele și acele de preparare sunt plasate într-un pahar cu alcool 96%. Înainte de fiecare manipulare, sculele sunt arse pe flacăra unei lămpi cu alcool. În cazul afectării sterilității, microorganismele (fungi, bacterii) se dezvoltă bine pe mediu, perturbând compoziția mediului și suprimând creșterea explantelor plantelor.
Vesela, halate, bumbac, hârtie, apă distilată, mediu nutritiv este sterilizat în autoclave sub presiune de abur de 1-2 atmosfere și o temperatură de 120 ° C timp de 20-60 min, în funcție de volumul materialului retortă.
Flaky, rafturi cu vată medie, de vată, hârtie, halate înainte de autoclavare, învelite în hârtie de celofan sau așezate în biciclete.
Uneltele metalice nu pot fi autoclavate, deoarece rugina este generată de abur. Prin urmare, ele sunt sterilizate cu căldură uscată în termostate cu o temperatură de 170-250 ° C timp de 1-2 ore.
Lucrări de laborator nr. 1
Tema. "Organizarea și echipamentul laboratorului de biotehnologie, regulile de lucru în el"
Materiale și echipamente:
Mensure (50, 100, 250 ml), suporturi cu tuburi, instrumente (forceps, bisturie, foarfece, ace preparirovalnye), detergenți (spălare pudră), bicromat de potasiu, hipoclorit de sodiu.
1. Să se familiarizeze cu dispozitivul laboratorului biotehnologic.
2. Sub îndrumarea instructorului, stăpâniți principiile de lucru ale autoclavului, dulapului de uscare, distilare și alte echipamente auxiliare.
3. Vasele îmbibate în soluții de hipoclorit de sodiu în detergent se spală temeinic (detergent), se clătește cu apă curentă de 8-10 ori, plasați 4-6 ore în bicromat de potasiu (un amestec de acid sulfuric și dicromat de potasiu), se spală cu apă caldă, apoi de două ori distilat.
4. Mâncărurile pure trebuie așezate într-un dulap de uscare timp de 2 ore la o temperatură de 100-130 ° C.
5. Produse uscate pentru depozitare aproape cu dopuri de bumbac, folie, celofan.
Testați întrebările la tema 1.
1. Cum este organizat laboratorul de biotehnologie?
2. Cum se sterilizează mediile nutritive, vasele, apa distilată, uneltele?
3. Cum se sterilizează camera de laborator?
3. Diversitatea și pregătirea mediilor nutritive
3.1. Tipuri de medii nutritive și o prezentare generală a compoziției acestora
În funcție de speciile de plante, este necesar să se testeze atât medii solide (agarizate) cât și lichide nutritive. Uneori, mediile lichide au avantajul, deoarece oferă o mobilitate mai mare a elementelor trofice. De exemplu, atunci când reproducerea de trandafiri a fost mai mult succes cultivarea lăstari pe un mediu cu două straturi: strat inferior - agar superior - lichid. Cu privire la eficiența reproducerii poate influența, de asemenea, localizarea explantului (orizontală sau verticală), tipul de dopuri (bumbac, plastic, sticlă, metal, etc.), precum și raportul dintre volumul și numărul mediu de cultură explantelor de iluminare și de schimb de gaz explantelor optime.
Compoziția mediului nutritiv trebuie selectată pentru fiecare specie de plante. Reproducerea microclinică este afectată de hormoni, săruri minerale, vitamine și carbohidrați. Când se înmulțește in vitro, Murasige și Skoog, Gamborg, Heller și alții sunt adesea folosiți. De obicei, se utilizează mediul Murashige-Skog (MS), care conține mult azot anorganic, care stimulează procesele de organogeneză și embriogeneză somatice. Problema raportului optim dintre NH5 și NO3 rămâne deschisă, deoarece datele din literatură sunt foarte contradictorii și nu există o rețetă universală pentru toate speciile de plante. Ca sursă de nutriție cu carbon, se folosesc diferiți carbohidrați, cum ar fi zaharoza, glucoza, fructoza, galactoza. Culturi diferite necesită concentrații diferite de carbohidrați în diferite stadii ale reproducerii microclinale.
Componentele mediului pentru cultivarea celulelor și țesuturilor vegetale pot fi împărțite în șase grupe principale care reflectă în mod normal ordinea prepararea soluțiilor concentrate stoc: macronutrienti, micronutrienti, sursa de fier, vitamine, surse de carbon, fitohormoni.
Baza pentru toate mediile nutritive pentru cultivarea explantelor de plante este un amestec de săruri minerale. Acestea sunt compuși ai azotului sub formă de nitrați, nitriți, săruri de amoniu; fosfor - sub formă de fosfați; sulf - sub formă de sulfați; precum și sărurile solubile ale K +, Na +, Ca ++, Mg ++. Fierul este utilizat sub forma de chelati [FeO4 sau Fe2O4 + EDTA (acid etilendiaminotetraacetic) sau sarea sa de sodiu Na EDTA (Trilon B)] - forma cea mai ușor disponibile pentru a stăpâni țesuturile vegetale.
Azot, fosfor și sulf sunt parte a compușilor, proteine, lipide, acizi nucleici organici. Fier, zinc, mangan, molibden, cobalt, în combinație cu porfirinele formând macromolecule pigmenți fotosintetici (clorofila), enzimele redox (catalaza, peroxidaza, polifenoloxidază). Prin urmare, toți acești compuși au o funcție structurală în celule și țesuturi. În același timp, ionii K +, Na +, Ca ++, Cl -, H + este necesară pentru reglarea pH-ului mediului și menținerea gradienților celulare fiziologice (turgescența, presiunea osmotică, polaritate).
Carbohidrații la o concentrație de 20-60 g / l sunt adăugați la mediul nutritiv ca sursă de carbon pentru macromolecule biologice, precum și pentru cultivarea țesuturilor heterotrofice (calli și suspensii). De obicei, acestea sunt dizaharide (zaharoză), monozaharide (hexoză: glucoză și fructoză, pentoză: xiloză și altele). Polizaharidele din mediul nutritiv nu sunt practic utilizate. Doar câteva tipuri de enzime hidrolitice conținând țesuturi (tumorale) sunt cultivate pe mediu cu amidon, rafinoză, celobioză.
Pentru a stimula reacții biochimice din celula utilizată este catalizatorii biologic-parametru - vitaminele B (B1, B6, B12), C (acid ascorbic), PP (niacin) mezoinozit.
Tiamina (B1) face parte din decarboxilaza piruvatului implicate în conversia glucidelor. parte pirofosfat Tiamina a enzimelor decarboxilare oxidativă a ceto acizilor (piruvic și cetoglutaric) este un transcetolază coenzima.
Pyridoxina (B6) sub formă de ester al acidului fosforic face parte din enzimele de decarboxilare și transaminare a aminoacizilor.
Niacina (PP), sub forma unei amide este o parte din dehidrogenaze DNA și NADH catalizează donor-acceptor de lanț H + (H + retragerea moleculelor de substanțe organice).
Pentru controlul procesului de morfogeneză în cultura de țesuturi sunt necesare de creștere și dezvoltare regulatoare biologice - fitohormoni. Aceste substanțe afectează diferențierea și dedifferentiation celulelor și țesuturilor, inițierea histogeneză induce diviziunea celulară și elongație, sunt implicate în procesele de îmbătrânire și de maturizare, fie stimulează sau inhibă creșterea și dezvoltarea culturilor celulare, determină formarea unui etaj. In cercetarea biotehnologică din ce în ce utilizează hormoni care stimulează creșterea și dezvoltarea: auxine, citochinine, giberelinelor.
Auxine: IAA - Acid indolil-3-acetic, IMC - AAN acidului indolil-3-butiric - Acid naftilacetic, 2,4-D - acid 2,4-diclorfenoxi-acetic.
Cytokinine: kinetin-6-furfurilaminopurină, zeatin, NN-difenil-uree, 6-BAP-6-benzilaminopurină.
Gibbereline: acid giberelic.
Ca aditivi biologici pentru inducerea calusului primare pot fi utilizate extracte din plante (10-15% din volumul total al mediului): lapte de cocos (endosperm cocos lichid), extracte din miezuri imature de porumb (de preferință în faza de lapte), care conțin cytokinins - Kinetin și zeatin (aminopurines 6-substituit) și NN-difenil.
Cultură in vitro sunt utilizate medii lichide și agarizate (solide). Mediile lichide sunt utilizate pentru cultivarea de suspensii, calli, organe și țesuturi izolate, plante regeneratoare. Pentru a menține explante în tuburile de testare cu medii, sunt amplasate poduri speciale - suporturi din hârtie de filtru sau materiale poroase sintetice.
Mediile agar sunt preparate pe bază de agar-agar-polizaharidă, care face parte din alge marine, care formează un gel cu apă la pH 5,6-6,0. Uneori, gelurile de poliacrilamidă (biogeluri) P10 și P200 sunt utilizate ca agenți de etanșare și agar-agar.
Pentru soluțiile de nutrienți artificiali, soluțiile de macro- și microsalți sunt preparate în prealabil și utilizate în mod repetat. Acestea sunt soluții mamă (concentrate). Sunt depozitate în condiții speciale: macro și micro-săruri în frigider în recipiente cu dopuri din sticlă tampon la 0 ... + 4 о С; vitamine, fitohormoni, enzime, extracte vegetale - la -20 ° C, în vase mici de 5-10 ml cu dop (penitsillovye fiole).
Soluțiile stocurilor de macroaltoți depășesc de obicei concentrația de lucru de 10-40 de ori, microsalturile - 100-1000 de ori, vitaminele - de 1000 de ori.
Soluțiile de fitohormoni ar trebui, de preferință, să fie pregătite imediat înainte de a lucra cu mediul.
Pentru a prepara o soluție stoc de macro și microsalți, fiecare sare este dizolvată într-o ceașcă separată când este încălzită, apoi drenată și adusă la volumul dorit. La amestecul răcit s-a adăugat o soluție de săruri mikrosoley ultima molibden și makrosoli - soluție de săruri de magneziu (pentru a evita precipitarea).
Soluțiile stoc de clorură de calciu și chelat de fier (sulfat feric + EDTA sau Na EDTA-Trilon B) sunt preparate și depozitate separat de alte săruri.
Soluțiile concentrate de vitamine sunt preparate după cum urmează: Porțiunile de 10 ori cântărite sunt dizolvate în 10 ml de apă distilată fiecare separat.
Phytohormonele sunt substanțe slab solubile în apă. Prin urmare, 100 mg de pre-dizolvat în cantități mici (0,5-2,0 ml) de alcool (auxine, gibereline), 0,5-1 N HCI sau KOH (cytokinins) și apoi încălzite până la dizolvare completă (cu excepția acidului abscisic și kinetin ) și ajustat la volumul de 100 ml (1 ml conține 1 mg de substanță).
Înregistrări ale principalelor medii nutritive utilizate în propagarea microclonică a plantelor
pe complexe tehnologice moderne în ingineria mecanică. Se precizează principalele prevederi ale standardului educațional federal în domeniul pregătirii 220700, calificarea (gradul) - licența.
Programul educațional principal
disciplina, formarea studenților în competențe culturale generale definite prin programul educațional de bază în direcția 020400.62 "Calificarea biologică" ciclul de licență Disciplina educațională "Botanică" Scopul studiului disciplinei este de a forma.
formarea disciplina competențelor culturale generale ale elevilor definite direcție osnovnoyobrazovatelnoyprogrammoypo 020400 0.62 «Biologie» calificare „ciclu«de licență. Uchebnayadistsiplina»Botanica Scopul disciplinei formei.
Mașini și echipamente tehnologice. Training de profil "Mașini și dispozitive de producție alimentară". Calificarea (gradul) absolventului - licență.