Secvența genomului este doar o secvență a acelorași patru litere în variație infinită. Privind la ea, nimeni nu-și poate calcula imediat funcția. Cu toate acestea, prin introducerea unei secvențe de baze în locul corect din genom, puteți obține indiciul pentru rezolvarea funcției sale. Harta genomului este o schemă grafică care permite cercetătorilor să navigheze în genom, să caute în ele locații care pot fi importante și interesante.
În cea mai simplă formă, o hartă a genomului este o linie de-a lungul întregii lungimi a cărora sunt diferite puncte de referință, marcate cu litere și cifre, care permit cercetătorului să identifice caracteristicile individuale. Harta nu este aceeași cu secvența bazelor genomului. Locația genelor pe hartă poate fi calculată fără a determina succesiunea bazelor. Localizarea aproximativă a genelor, tulburări în care sunt asociate cu o serie de boli ereditare, a fost stabilită cu mult înainte de secvențierea genomului uman atunci când a fost investigată moștenirea diferitelor trăsături legate. Metodele utilizate în acest proces sunt descrise în detaliu în cursul "Genetică". Aici ne vom referi doar la tiparele generale ale unora dintre ei.
Cum sunt construite hărțile genetice? Să presupunem că este necesar să aflăm locația unei anumite gene care provoacă boala, care este exprimată prin anumite semne fenotipice. În primul rând, mai multe familii, reprezentate de mai multe generații, ale căror membri suferă de această boală, sunt examinate pentru a afla cu ce alte semne genetice boala este asociată.
Genele oricăror trăsături care tind să fie moștenite, împreună cu o predispoziție la o boală, pot fi localizate pe un cromozom alături de genele care provoacă boala. Acestea sunt alese ca markeri pentru gena dorită. După ce au fost determinați mai mulți markeri cu o locație cunoscută pe cromozom, este posibil să se stabilească localizarea genei care provoacă boala cu o mare precizie (până la câteva milioane de bp).
Studiile se concentrează apoi pe partea genomului care transportă gena și pe căutarea unei gene care are o secvență de bază diferită la persoanele sănătoase și bolnave sau o genă ale cărei funcții pot fi asociate cu boala. Astfel s-au identificat genele asociate cu fibroza vezicii urinare și boala Huntington. Cu toate acestea, acest mod este lung și laborios, astfel încât obiectivul geneticienilor rămâne dezvoltarea unor hărți mai detaliate ale genomului, care vor permite să se găsească cu exactitate secvențele necesare în fiecare caz specific.
Există două tipuri de hărți genetice - hărți genetice de legătură și hărți fizice.
Hărțile legăturii genetice arată ordinea localizării genelor pe cromozom și distanțele relative dintre ele. Pentru prima dată o astfel de hartă a fost făcută la începutul secolului al XX-lea. în laboratorul Universității Columbia, condus de Thomas G. Morgan (Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină, 1933). Obiectul acestor studii genetice clasice a fost selectat de muște de fructe Drosophila melanogaster, mărimea mică și nemulțumirea a permis să efectueze experimente cu sute de muște.
În plus, ele s-au multiplicat rapid și s-au dovedit a fi extrem de prolifice - o nouă generație a apărut la fiecare 12 zile, iar femela a depus până la 1.000 de ouă. Flying mustele au 4 perechi de cromozomi, inclusiv o pereche de muste genitale. Morgan observă că, dacă un bărbat cu ochi albi încrucișat cu o femeie cu ochi roșii, atunci urmașii ar avea ochi roșii; dar când se traversează puștii unul cu celălalt, se manifestă din nou "ochii albi", dar numai la bărbați. Morgan a concluzionat că acest semn și alte semne "limitate de gen", de exemplu, orbirea de culoare la persoanele care afectează numai bărbații, ar trebui să fie localizate pe cromozomul X.
Aceasta a fost prima mutație asociată cu un anumit cromozom. În următorii ani, au fost identificate mai mult de 40 de mutații ale muștelor de fructe, dintre care unele au fost legate între ele. Acum sunt patru tipuri principale de moștenire: autozomal dominant, autozomal recesiva (se referă la 22 m perechi nonsexual de cromozomi) precum X-legată dominant și X-linked recesivă.
Schema experimentului lui Morgan cu muște cu ochi albi este prezentată în Fig. 3.1. Acest experiment demonstrează cazul moștenirii recesive legată de X. Deci, genele de caracteristici legate sunt situate pe un cromozom. Pentru a determina grupul legatura genetica Morgan mutanți cu muște skew normale și Descendenții rezultați peste si peste din nou, până când a fost obținut un număr suficient de muște cu păstrarea anumitor mutații pe cromozomul.
Deoarece locația lor era cunoscută, astfel de mutații au servit drept markeri. Apoi, masculii cu noua mutație au fost traversați cu femele care transportau aceste mutații marker. După cum sa observat deja, ochii albi au fost rezultatul unei mutații pe cromozomul X. Dacă noua mutație a fost manifestată în mod constant în muștele cu ochi albi, aceasta însemna că a fost localizată și pe cromozomul X.
Fig. 3.1. Rezultatele traversării muștelor cu ochi albași cu bărbatul cu ochii roșii. Triunghiurile negre sunt etichetate cu cromozomi X, care poartă semnul dominant al ochiului roșu. Triunghiurile inversate albe indică cromozomii X, care poartă semnul recesiv al ochilor albi. Gray triangles - Y cromozomi
Cu toate acestea, au existat semne care au fost transmise împreună, dar nu întotdeauna, de exemplu, semnele ochiului alb și aripa rudimentară. Acest efect este explicat prin trecerea (schimbul între secțiunile de gene ale cromozomilor) în timpul meiozei. Dacă suntem interesați de gene localizate pe același cromozom, dar situate departe una de alta, ca urmare a crossing-over în timpul formării celulelor sexuale, ele sunt susceptibile de a cădea în celule diferite. Clar localizate genele nu vor fi separate la trecerea peste.
Astfel, este posibil să se stabilească nu numai determinarea genei pe un anumit cromozom, dar aproximativ determina dispunerea reciprocă a genelor pe ea, având în vedere cât de des apar în descendență din încrucișări între. Folosind rezultatele obținute, personalul de laborator Morgan construit prima harta a cromozomului X a zbura de fructe (fig. 3.2). Ulterior, au fost construite primele hărți genetice și alte 3 cromozomi. De fapt, acestea sunt prototipul hărților genetice moderne.
Fig. 3.2. O vizualizare aproximativă a primei hărți genetice care arată localizarea celor cinci semne pe cromozomul de zbor de fructe
Hartile lui Morgan au fost construite pe trăsături genetice care erau vizibile fizic în muștele examinate. Astăzi, hărțile mult mai complexe de legare a genei sunt construite pe definiția moștenirii secvențelor ADN specifice. În particular, pentru aceasta se folosește o metodă bazată pe polimorfismul lungimii fragmentului de restricție (RFLP).
Pentru apariția alelelor este suficient ca două gene omoloage să difere numai printr-o singură nucleotidă. Dacă probabilitatea apariției unei astfel de substituții (mutație) este mai mare de 1%, atunci se spune că are loc polimorfismul genetic. Înlocuirea unui singur nucleotid poate provoca o schimbare semnificativă a proprietăților proteinei codificate, comparativ cu cea normală.
Cu toate acestea, multe substituții cu un singur nucleon nu conduc la sinteza produselor genetice modificate. În plus, înlocuirea are loc în regiunile necodificatoare (ca în genomul uman, ele constituie aproximativ 90%), care nu duc la modificări, sunt distribuite pe întreaga lungime a cromozomului și sunt siturile polimorfice, care sunt utilizate ca markeri pentru marcare genetică. Dar mai întâi trebuie să găsiți aceste site-uri polimorfe.
Metoda este după cum urmează. ADN-ul este digerat cu o enzimă de restricție specifică la locurile specifice. Dacă există o singură înlocuire a nucleotidelor în situsul de restricție, enzima de restricție nu o recunoaște și nu are loc divizarea. În același timp, ea încă recunoaște și împarte site-ul intact într-un alt cromozom. Astfel, ca rezultat al tratamentului cu endonuclează de restricție a acestor două alele, se obține un set de produse diferite (fragmente de ADN de diferite lungimi), care sunt apoi identificate prin hibridizare cu o probă specifică.
Fenomenul unui situs de restricție modificat care apare într-o populație care conduce la formarea unui set specific de fragmente ADN se numește polimorfism de lungime a fragmentelor de restricție. Locurile de restricție polimorfe formează loci marker pe cromozomul în care sunt prezenți. În prezent, au fost identificate mii de loci RFLP, care au crescut semnificativ numărul alelelor care pot fi utilizate pentru cercetarea genetică.
Determinarea alelelor locusului RFLF prezente pe cromozomii acestui individ se numește genotipare (tastarea ADN-ului). Moștenirea locurilor RFLF are loc în conformitate cu legile Mendel și este posibil să se urmărească transmisia lor în pedigree. Folosind legătura genei unei boli cu locus marker, este posibil să se determine localizarea cromozomală a acestei gene. Cu ajutorul lor, genele unor boli ereditare, cum ar fi miodistrofia lui Duchenne și fibroza chistică, au fost izolate.
Un alt tip de loci polimorfe sunt așa-numitele repetări tandem scurte (STR, din repetițiile scurte tandem engleză). Faptul este că aproximativ 100.000 de blocuri de repetiții dinucleotidice care conțin până la 40 de elemente CA / GT sunt distribuite uniform pe genomul uman. Orice astfel de unitate, localizată într-o regiune specifică a cromozomului, este transmisă de la o generație la alta cu păstrarea numărului de elemente repetate. În genom, există, de asemenea, repetiții (AT) n, (ATG) n, (ATCG) n.
Pentru a identifica polimorfa STR-loci ecranate bibliotecă genomică umană care cuprinde inserția unei dimensiuni mici (aproximativ 1000 bp), folosind o sondă oligonucleotidică adecvată. Pentru n-repetițiile (CA), se utilizează de obicei o sondă (CA) 15. Fiecare inserție pozitivă este secvențiată pentru a stabili secvențele de lungime repetată și nucleotidică ale porțiunilor laterale ale acestora. Pentru a determina dacă secvențele de flancare ale singur exemplar, efectuează hibridizarea la sondele complementare, iar în cazul în care se constată că secvențele găsite în genomul odată perechea de primeri sintetizați complementare acestora și să efectueze amlifikatsiyu CA-repetiții.
Mai mult, folosind această pereche de primeri, se efectuează testarea PCR a ADN-ului obținut de la un număr mare de indivizi. Lungimea produselor PCR (utilizată la aproximativ 200 bp) este determinată prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă. În cazul în care lungimea segmentului amplificat astfel, același pentru toate probele de testare a ADN-ului, înseamnă că nu se repetă este polimorfic, și invers, dacă sunt generate produse PCR de lungimi diferite, indică acest polimorfism STR (STR-polimorfism, STRP).
Diferențele în lungimea acestui loc sunt alele care apar la o frecvență de 20% sau mai mult. Folosind STRP-loci pentru cartografiere genomi, în comparație cu loci RFLP, are o serie de avantaje:
1) pentru a le identifica, sunt necesare informații despre secvența nucleotidică a unei perechi de primeri, care pot fi stocate într-o bază de date computerizată;
2) aceste loci sunt distribuite uniform în genom;
3) frecvențele lor sunt foarte mari, ceea ce asigură o heterozygozitate ridicată;
4) ele sunt ușor identificate după amplificarea prin PCR.
Harta fizică a întregului cromozom sau a regiunii sale oferă o imagine directă a localizării genelor în ADN, ceea ce facilitează identificarea și caracterizarea acestora. Există în prezent, după secvențializarea genomului uman, hărțile genomice combină caracteristicile ambelor tipuri de hărți. S-au creat site-uri electronice în care specialiștii pot obține informații despre conținutul diverselor hărți cromozomiale, inclusiv reprezentarea lor grafică completă, asupra metodelor de cercetare genomică și software.
În Fig. 3.3. este prezentată o hartă a cromozomului de Micobacterium tuberculosis. Compararea secvențelor tulpina clinice CDC1551 si de laborator H37Rv a relevat o mutație (substituție și inserție), responsabil pentru patogenitatea probei clinice, care la rândul său poate îmbunătăți metoda diagnostic pentru a intelege mecanismul bolii si de a propune un tratament adecvat și eficient.
Fig. 3.3. Harta genomului cromozomului Micobacterium tuberculosis. Pe circumferința exterioară, este prezentată localizarea genelor care codifică proteinele corespunzătoare comune pentru tulpinile CDC1551 (clinice) și H37Rv (laborator). Fiecare dintre cercurile interioare reflectă diferențele dintre aceste tulpini. De exemplu, cel de-al doilea cerc indică localizarea substituțiilor sinonime, a cincea - inserțiile găsite în tulpina CDC1551 etc. [1] (cu permisiunea Societății Americane de Microbiologie)
NA Voinov, TG Volova