Rapoarte >> Botanică și gospodării din mediul rural >> Metode de diagnosticare și prevenire a contaminării microbiene în transplantul de embrioni
Mediul destinat cultivării bacteriilor pe vase a fost distribuit în 20-25 ml și lăsat timp de câteva minute până când a fost stabilit agarul. Atunci când a trebuit să crească microorganismele pe un mediu agarizat sub formă de colonii izolate, vasele au fost așezate cu capul în jos în termostat după însămânțare.
Eșantionarea pentru studii bacteriologice a fost efectuată în toate etapele de preparare a embrionilor pentru transplant.
2.2.1 Pregatirea unui laborator, a ustensilelor si a instrumentelor pentru manipularea embrionilor
În spațiile de laborator, unde s-au pregătit unelte, echipamente, ustensile, medii pentru primirea, transplantul și crioconservarea embrionilor, sa efectuat zilnic o curățare umedă.
Toate echipamentele cutiei, pereții, podeaua au fost spălate cel puțin o dată pe săptămână cu detergenți și au fost șterse cu soluții dezinfectante. Pentru dezinfecție a fost utilizată o soluție 2% de cloramină "B". Înainte de lucru, cutia și alte unități de laborator au fost iradiate timp de 40-60 minute cu raze ultraviolete la o rată de 2-3 W / m.
În cutie, în ziua lucrului cu embrionii, a fost efectuată o prelucrare suplimentară a meselor și a echipamentelor cu etanol 96 °.
Toți angajații laboratorului au lucrat în halate sterile și pantofi de schimb. Salopetele (halate, eșarfe, pălării, îmbrăcăminte din tifon) au fost spălate cel puțin o dată pe săptămână, cu fierbere obligatorie și călcare. Pantofii în mod regulat după muncă au fost spălați și dezinfectați cu soluție 2% de cloramină.
Instrumentele utilizate pentru lucrul cu embrioni, vasele au fost sterilizate în diferite moduri, în funcție de materialul din care sunt fabricate.
Sticlăria (fiole, flacoane, pipete, cilindri și așa mai departe.), Precum și instrumente pentru hârtie de transfer de embrioni pergament acoperite și sterilizate prin autoclavare la 1,5 atm. în 30 de minute. Apoi a fost uscat la o temperatură de 80 ° C timp de 60 de minute.
Seringile, acele, penseta, foarfecele, oglinzile vaginale și sistemele de spălare a embrionilor au fost sterilizate prin fierbere timp de 30 de minute.
Înainte de sterilizare nou sticlărie spălate în apă de la robinet cu săpun sau detergent, folosind perii și rockfish, clătite și imersate în soluție de acid clorhidric (1 lingura. Lingura acid clorhidric în 3 litri de apă distilată) și se menține acolo timp de 24 ore. După aceea, vesela a fost spălată cu apă curentă, apoi repetată în apă bi- și tridistilată și uscată.
Sticlăria folosită a fost spălată într-o soluție fierbinte de 2-3% de bicarbonat de sodiu, apoi clătită bine cu apă de la robinet, apoi cu apă bi- și tridistilată și uscată.
De asemenea, obiectele metalice uzate au fost spălate în soluția de sodă menționată mai sus, clătite cu apă de la robinet, apă bi- și tridistilată și uscate.
De unică folosință polimer instrumente (. Fiole, pungi, pipetă, etc.), sterilizat prin iradiere bactericidă box lămpi de BUF # 8209; 30 sau PRK # 8209; 2 timp de 20 min. de ambele părți la o distanță de 20 cm față de sursa de iradiere.
Uneltele din cauciuc (cateter pentru eluție) au fost tratate cu alcool rectificat la 70 ° C. Suprafața exterioară a fost sterilizată prin iradierea cu lămpi BUF # 8209; 30 timp de 20 de minute. la o distanță de 20 cm de sursa de raze ultraviolete, înainte de lucru, a fost clătită de 2-3 ori cu mediul Dulbecco.
4.2.2 Pregătirea donatorilor și a beneficiarilor
Pregătirea donatorului a început în arenă cu curățarea și spălarea pielii și a membrelor. Apoi animalul a fost transferat în sala de operație, fixat în mașină, iar rectul a fost eliberat din conținut. Pentru ameliorarea tensiunii rectului, anestezia epidurală a fost efectuată cu o soluție 2% de novocaină într-o doză de 5 ml. Conform instrucțiunilor zonei vulvei și perenealnuyu spălat bine cu apă și săpun, se usucă cu un șervețel, spray dezinfectat „Septoneks“ sau 70 ° etanol th. În experimente, rădăcina cozii, a regiunii perineale și a organelor genitale externe a fost spălată cu grijă cu apă caldă și săpun, uscate cu un tampon de bumbac. Pielea vulvei și a tractului genital (vagin vestibular, vagin și cervix vaginal) au fost irigate cu soluția Lugol. În acest scop, coada a fost pusă deoparte în față, fixată cu o frânghie de peretele frontal al mașinii. În vagin a fost injectată o oglindă vaginală pregătită. Prin oglinda deschisă, membranele mucoase ale tractului genital au fost irigate cu soluția lui Lugol. La 15 minute după salvarea tractului genital, embrionii au fost îndepărtați.
A fost efectuată pregătirea destinatarilor pentru transplantul de embrioni, precum și pregătirea donatorilor pentru extracția non-chirurgicală a embrionilor. Pentru a preveni devierea microflorei în uterul recipientului, sistemul de reproducere a fost dezinfectat cu soluția Lugol în 15 minute. înainte de transplantarea embrionilor.
Prepararea soluției de Lugol.
Soluția de Lugol a fost preparată conform următoarei formule:
iod cristalin 1,0 g
Iodură de potasiu - 2,0 g
apă distilată - 300,0 ml.
S-a adăugat 2,0 g de iodură de potasiu dizolvat în 100 ml de apă 1,0 grame de iod cristalin și plasat 10-12 ore într-un incubator, până la dizolvarea completă a iodului. În acest caz, iodul se dizolvă în iodură de potasiu. Soluția a fost turnată într-o sticlă de măsurare mare și volumul total a fost ajustat la 300,0 ml. Apoi a fost filtrat și depozitat în flacoane de sticlă întunecată. Soluția nu a fost utilizată mai mult de 30 de zile.
4.2.3 Extracția și pregătirea embrionilor pentru transplant
Extracția embrionilor a fost efectuată în ziua 7-8 a ciclului sexual printr-o metodă non-chirurgicală. Înainte de operația donatorului, a fost preparată procedura descrisă în secțiunea 1.2, apoi 5-7 ml de novocaină 2% au fost administrate epidural, în funcție de greutatea animalului. Nehotărâtul a fost injectat suplimentar cu 0,3-0,5 ml de romb. Palparea rectală a fost utilizată pentru a evalua starea aparatului reproducător, pentru a calcula numărul de corpuri și foliculi galbeni. Pentru a spăla embrionii, s-au folosit catetere de diferite modele. Lichidul de spălare a fost alimentat printr-un sistem închis prin gravitație dintr-un container situat în scaunul superior al trepiedului deasupra donatorului. Spălarea cornului uterin a fost efectuată de 8-10 ori, introducând 60-50 ml de mediu de spălare. Neomogene un corn uzat 450-500 ml de mediu Dulbecco modificat suplimentat cu 1% ser de bovine inactivat.
In experimentele științifice și industriale reajustare spălare complexe medii tampon a fost adăugat ampicilina antibiotic gentamicina la concentrații de 12 pg / ml și 100 U / ml, respectiv. Doza bactericidă a preparatelor de dezinfectare a fost testată pe tulpini de microorganisme, atât monocultura cât și în asociere, prin diluare în serie. Inofensivitatea preparatelor sanitare pentru embrioni a fost determinată prin metoda de cultivare a embrionilor de animale din specia bovină în medii care conțin diferite doze de preparate testate.
Eficacitatea aplicării medicamentelor de dezintoxicare a fost luată în considerare de rezultatele atașării la embrioni.
Spălarea a fost apărată timp de 15-20 de minute. la o temperatură de 37 ° C într-un termostat. Supernatantul a fost aspirat cu un sifon. Sedimentul a fost turnat în vase sterile Petri cu un fund dungat. Căutarea embrionilor a fost efectuată sub microscop stereoscopic MBS-9.
Embrionii detectați au fost transferați cu o microserină sterilă într-un mic vas Petri cu un diametru de 40 mm. Viabilitatea embrionilor a fost determinată conform metodei general acceptate de evaluare a stării morfologice a embrionului (V. Shea et al., 1976), având în vedere compactitatea, simetria, densitatea acestora. (Instrucțiuni privind transplantul de embrioni de bovine, 1987).