Prepararea ADN-un singur șablon catenar
dobândește prepararea moleculelor de ADN pentru acest proces. Astfel, dacă metoda de secventiere ADN a degradării chimice a fost necesară pentru a avea un singur sau dublu catenar fragment care poartă aceeași (omogenă) din capetele lor doar o etichetă, o metodă enzimatică pentru secvențierea nemarcată necesită un șablon ADN și un dezirabil monocatenar. Cu toate că, în corectitudine, trebuie remarcat faptul că matricea ADN, care poartă nici un marcaj (inclusiv radioactive), în majoritatea cazurilor, nu va avea un efect notabil asupra autoradiografie finală a diferenței mari în însăși matricea de dimensiune și nou sintetizată într-o terminație a lanțului ADN . În ceea ce privește șablonul DNA, un capăt al cărui poartă o etichetă de biotină în moleculă, în care caz este posibil sorbția pe faza solidă, de exemplu, pe particule magnetice cu streptavidină și ținând așa-numita secventiere fază solidă. Când această ieșire biotinilată etichete în amestecul final soluție terminator conținând ADN-ul cu lanț complementar este deja etichetat oarecum diferit și adaptată pentru aplicarea pe un gel de secvențiere, nici măcar să apară.
Revenind să se pregătească matrici, trebuie spus că, din cauza unor dificultăți în obținerea mono-catenar din fragmente de ADN dublu catenar, primele succese în enzimatica secventiere Vania au fost realizate cu un singur ADN naturale, cum ar fi bacteriofagul și fH17 fl [Sânger et al. 1977a; 1973]. sunt necesare pentru a aplica experimentatori pentru a obține șabloane ADN mono-catenar adecvate pentru secvențierea, metoda enzimatică eforturi semnificative, la început împiedicată pe scară largă această metodă, deoarece timpul necesar pentru a le primi, este o componentă majoră a procesului. Astfel, in primele experimente pentru secvențierea ADN a sugerat clonarea fragmentului interes în bacteriofagul lambda, urmat de lanțuri de separare [Davies 1982] printr-o ultracentrifugare foarte lung, cu gradient de densitate de clorură de cesiu, cu poli (U, G), forma suficient de lung [Szybalski et al. 1971]. O altă modalitate de a obține matrici pentru secventierea, de asemenea, bazate pe circuitele de divizare, dar cromatografia a fost modul de donare fragmente ADN într-un vector special rKN47, construit pe baza plasmidei pBR322 și care conține un poli (dA): poli (dT) lungimea fragmentului duplex de aproximativ 100 pb [Hayashi, 1980]. Acest lucru a permis ADN plasmidic denaturat este suficient pentru a efectua o separare eficientă a circuitelor Clonate inserturi împreună cu secvențe de vector, una dintre care transportă un poli (dA) -, iar celălalt - poli (dT) -uchastki coloană cu oligo (dT) - și oligo ( dA) -celuloză respectiv.
preparare enzimatica a ADN monocatenar adecvate pentru secvențierea, realizată destul succes folosind exonuclează III [Smith, 1979]. În acest caz, un fragment de ADN a fost clivat cu una sau două endonucleaze de restricție corespunzătoare, și ca urmare a exonuclează prelucrării ulterioare III produce secționarea simultană a ambelor catene ADN în direcția 3 „→ 5“ și educație sau două fragmente monocatenare care nu sunt scindate în continuare exonuclease III, sau structuri cu restul porție (în caz de digestie incompletă) dublu spiralat. Deoarece exonuclează III cliveaza diverse nukleotidmonofosfaty cu inegală viteză [Linxweiler, Horz, 1982], apoi hidroliza completă a unui fragment ADN format, tind să fie oarecum diferite ca mărime între un singur catenar subfragmente care constituie aproximativ jumătate din fragmentele de ADN originale fiecare.
Dovedit pregătire foarte convenabil de șabloane ADN mono-catenar după clonarea lor în vectori pe bază de fag filamentos M13 [Messing și colab. 1981], care este dedicat unui număr mare de articole originale și comentarii [Sânger et al. 1980; Davies, 1982; Bankier, Barrell, 1983, 1988; Messing, Bankier, 1988]. Această abordare a făcut metode practic inutile descrise pe scurt mai sus, și datorită simplității sale a crescut dramatic disponibilitatea, deci popularitatea metodei enzimatice de secventiere ADN didezoksiter-minatorami.
Biologie monotorsionată f1 fag filamentos este de așa natură încât, în ciclul său de viață, trece dublu catenare etapă replicativ și izolat în această etapă a moleculei sale inelare utilizată ca un vector, cum ar fi plasmidic. Cea mai răspândită serie întreagă de vectori fagi M13tr proiectat de Messing et al. [Messing și colab. 1981; Messing, Vieira, 1982; Vieira, Messing, 1982; Messing, 1983; Norrander și colab. 1983; Yanisch-Perron și colab. 1985].
În ciuda faptului că, cu ajutorul unor vectori fagi sau fagemid pentru a obține molecule ADN mono-catenar nu prezintă probleme specifice, dorința de a nu de a petrece curățarea ADN-ul monocatenar de proteinele fagilor puternic legate forțat cercetatorilor de a dezvolta abordari pentru secvențierea molecule de ADN dublu catenar, fără să se oprească chiar înainte de faptul că calitatea rezultatele sunt întotdeauna cunoscute a fi mai rău decât secvențierea monocatenar a ADN-ului dublu catenar. (Aici, conceptul de „calitate“ secventiere „cantitate“, definită în acest caz, nucleotidele sunt foarte strâns legate, deoarece calitatea superioară a benzilor de pe gel de secvențiere autoradiografie „citit“, va fi mult mai multe dintre ele.) Deci, în ciuda potențial cele mai slabe rezultate, într-o mare număr de studii consacrate descrierii diferitelor abordări pentru a prepara ADN dublu catenar șabloane adecvate pentru secvențierea prin metoda enzimei dideoxi. O astfel de abordare aparent irațional explicată prin performanța generală îmbunătățită în toate procesul de secventiere ADN-ului prin economisirea timpului ca purificarea de șabloane ADN mono-catenar și deținerea necesară pereklonirovaniya inserții în fagi speciale sau vector fagmid.
Cu proces de descoperire amplificarea selectivă a oricărui fragment ADN prin PCR și dezvoltarea în continuare a acestei metode, o oportunitate de a pregăti special șablon dublu catenar pentru secvențierea ADN prin metoda enzimatică. Mai mult, recurgând la unele trucuri, este posibil să se obțină un șablon ADN sau îmbogățit pe același lanț, sau care au un singur lanț.
Prepararea ADN mono catenar matriță >>>>