Ce este Western Blot?
Identificarea proteinelor în amestecuri sau extracte de diferite țesuturi complexe este o probleme întâlnite frecvent. Folosind un instrument, cum ar fi un anticorp specific poate determina proteina țintă, cu un minim de timp și cheltuieli.
Metoda Western blot (Western blot) în prima etapă un amestec de proteine separate prin electroforeză în prezență de dodecil sulfat de sodiu (SDS), apoi transferat pe o membrană de nitroceluloză prin electroblotting. Esența acestei metode constă în faptul că gelul după electroforeză pe o membrană de nitroceluloză plasată între straturi de hârtie de filtru. Montate astfel un „sandwich“ este plasată într-un câmp electric, astfel încât complexele de plăci de gel de proteină SDS deplasa transversal și imobilizat (ca rezultat al adsorbției nespecifice) pe suprafața membranei nitroceluloză.
legarea complexului proteic-SDS cu membrana de nitroceluloză sunt implicate în principal forța natură electrică, iar această reacție este un sistem multi-punct și conduce la „împrăștiere“ proteine de pe suprafața membranei. Astfel, după electromigrației obținem pe replica nitroceluloză a gelului cu proteinele localizate în același mod ca și într-un gel de poliacrilamidă.
Următoarele SDS - electroforeză, electromigration și adsorbție a proteinelor din gelul la o proteină conformație terțiară membrană de nitroceluloză schimbat foarte mult, dacă la toate corect să vorbim despre existența structurii terțiare pentru o proteină după o astfel de prelucrare severă. De aceea, pentru detectarea imunochimică proteinei de testare sunt, de obicei numai utilizate mono- sau anticorpi policlonali specifici porțiunile liniare ale moleculei de proteină. Anticorpi specifici epitopii conformaționali (sau porțiuni, cuprinzând contacte intersubunitare) nu sunt în general adecvate pentru utilizare în metoda Western blotting.
După membrană de transfer de proteine a fost incubat secvențial cu anticorpi specifici pentru proteina de testare și apoi cu anticorpi secundari specifici pentru Fc-fragmente ale unui anticorp primar conjugat cu o enzimă (sau orice alt tip) etichetă (fig. 1 A). În cazul în care o etichetă este conjugat direct la primar, specifică anticorpilor antigen de test, anticorpii secundari nu sunt necesare (Fig. 1 B). Compusul format în locul localizare de proteine de testare complexe imune „manifesta“ cu un substrat cromogen (în funcție de tipul de etichetă).
Sensibilitatea și specificitatea metodei depind în mare măsură de ce fel de anticorpi utilizați în cercetare. Anticorpul utilizat ar trebui să fie specific unic, caracteristic numai pentru secvența de aminoacizi de proteină de test. In caz contrar, este posibil interacțiune (mai ales în cazul proteinelor extractelor grosiere) anticorpi cu mai multe molecule de proteine, care, la rândul său, va duce la apariția unor benzi colorate cu membrane multiple. Identificarea proteinei de testare într-un astfel de caz, este adesea dificil sau chiar imposibil.
Un alt factor important pentru a păstra în minte atunci când alegerea de anticorpi este de afinitate. Cu cât mai mare afinitatea anticorpului utilizat, cele mai luminoase și mai clare benzile proteice colorați, cu cât sensibilitatea metodei. Atunci când se utilizează anticorpii cu afinitate este posibilă obținerea o sensibilitate de 1 ng sau chiar mai mare.
Pentru a vizualiza rezultatul interacțiunii asociate cu un antigen de membrană și anticorpul utilizat anticorp secundar conjugat cu agenți capabili să dea un anumit semnal în anumite circumstanțe. De obicei, ca un astfel de agent este o enzimă (peroxidaza sau fosfataza) care produsul de reacție are o culoare și cade pe membrana ca un precipitat insolubil. De asemenea, în această metodă, puteți utiliza etichete fluorescente.
Fig. 1. Diagrama proteinei de test de colorare imunohistochimică: A - folosind un anticorp secundar conjugat cu un marker enzimatic; B - anticorp primar este conjugat direct la un marker enzimatic.
I. Prepararea gel și proteinele membranare și electromigrația
Gelul de poliacrilamidă după electroforeză a fost plasată într-o tavă cu un tampon de blotting (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicină, 10% etanol). Două foi de hârtie de filtru, tăiate la forma casetei și înmuiate tampon blotting pentru blotting a fost plasată în acea porțiune a casetei care se confruntă cu anod. Apoi plasate pe hârtie de filtru presoaked cu aceeași membrană tampon nitroceluloză, asigurându-se că între membrană și hârtia nu erau bule de aer. După aceea, membrana trebuie sa fie atent pus gel, din nou, acordând o atenție deosebită lipsa de bule de aer între gel și membrana. Finalizarea formarea a două straturi de tip sandwich de hârtie de filtru umectată sunt plasate pe suprafața gelului (fig. 2). Sandwich-ul rezultat este prinsă în casetă și plasată între electrozi astfel încât membrana se confruntă cu anod.
Fig. 2. Schema Electrotransferul proteinelor la membrana.
II. electromigration
Electrotransferul proteinelor la membrană de nitroceluloză a fost efectuată în tampon conținând 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicină, 10% etanol timp de 30-50 min, la o tensiune constantă de 100 V. Timpul electrotransport depinde de dimensiunea proteinelor portabile mai proteine timpul necesar pentru a electromigrația. Calitatea electromigration și amplasarea benzilor de proteină a fost evaluată prin colorarea membranei nitroceluloză cu o soluție de 0,3% Ponceau S în acid acetic 1%. Înainte de colorarea imunohistochimică membrana trebuie spălată de mai multe ori cu o soluție apoasă slab alcalină de Tris pentru a îndepărta colorantului nelegat cu proteine.
III. Colorarea imunochimice a proteinelor imobilizat pe o membrană de nitroceluloză
Pentru a bloca legarea nespecifică a anticorpilor plasează membrana a fost incubată sub agitare constantă la temperatura camerei timp de 30 minute în PBST (pentru o mai bună blocare poate fi utilizată soluție PBST conținând 10% lapte degresat). După blocarea, membrana a fost incubat timp de o oră la temperatura camerei și PBST agitare constantă, conținând 1-10 micrograme / ml de anticorpi specifici. Concentrația optimă a anticorpului este selectată empiric și depinde de afinitatea interacțiunii anticorpilor cu antigen. După incubare, membrana este clătită de 5 ori în PBST și se transferă soluția de anticorp secundar conjugat cu peroxidază din hrean. Conjugat de diluție este de obicei specificată de producător pe ambalaj, sau cercetătorul selectat empiric. În soluție, anticorpul secundar membrana a fost incubată 1 h, cu agitare constantă.
După spălarea temeinică (cel puțin 5 - 6 ori schimba tampon) PBST membrana a fost transferată într-o soluție de substrat cromogen conținând 3 mg de diaminobenzidină (DAB) și 10 pl de apă oxigenată 30% în 10 ml de 0,1 M Tris-HCI, pH 7,6. Incubarea a fost efectuată cu agitare 5 - 10 minute. Membrane după incubare cu substratul trebuie clătite cu PBST hârtie de filtru îmbibată uscat, și de a face imediat o copie electronică, scanare color. Dacă membrana este complet vindecat, vopsite în benzi de proteine palide, iar imaginea este mai puțin strălucitoare și ascuțite.
Notă: DAB este potențial toxic și cancerigen. Lucrați numai în mănuși de cauciuc!