Extras. materiale
Cultivați virusul este posibilă numai în celulele vii. În acest scop, orice sistem biologic: organismele animale, embrioni de pui, cultura de celule. Mai devreme, în etapele inițiale de dezvoltare a virusologie utilizate pe scară largă în acest scop la animalele de laborator organisme (iepuri, cobai, șoareci albi și șobolani, hamsteri aurii) și adesea - desigur susceptibil sensibile la un anumit animal și a virusului pasare (pui, porumbei, porci, pui, pui etc). Atunci când selectarea animalelor de laborator trebuie să îndeplinească următoarele cerințe: - animalele trebuie să fie sănătoase. Din nou admis la vivariu conțin în carantină (14 zile la șoareci și șobolani, restul de - 21 zile). Pentru a elimina infecțiile latente (ascunse) virale cum ar fi ectromelia șoareci albi, pneumonia virală, neuroinfection, metoda de control al animalelor efectuate asupra acestor agenți purtători infecții. Esența ei constă în prepararea unei suspensii de cadavre în acest scop, animalele și animalele administrate vivariu acesteia;
- animalele trebuie să fie sensibil la acest virus;
- vârsta animalului este de mare importanță: cele mai sensibile copii mici și nou-născuți, dar în unele cazuri, pentru a identifica cele mai luminoase semnele clinice ale bolii cu ajutorul animalelor adulte;
- animalele trebuie să fie de aceeași vârstă și greutatea corporală; mai potrivite pentru aceste animale liniare, adică, obținute ca rezultat al consangvinizării.
Selecția virusului infecție tropism se determină prin metoda, adică. E. Capacitatea de a reproduce în anumite tipuri de celule. Distinge virusuri neurotrope (virusul rabiei reproduce in celulele nervoase), dermotropnye (reproduse in celulele pielii - zosterian), pneumotropic (celulele pulmonare), politropic (reprodus în mai multe tipuri de celule), pantropic (reprodus în toate celulele absolut). Cunoașterea tropismul virusului, materialul este introdus în organe care conțin celule sensibile la virus.
Conțin virusul material poate fi introdus prin diverse metode, în fiecare caz, selectat cele mai potrivite. Înainte de infectarea locul injectării tratate cu atenție cu soluție de alcool 3% iod, strat vystrigaya dacă este necesar. Subcutan inoculat, de ridicare a pielii se pliază în spate, omoplati, genunchi falduri gât. Metoda intradermică constă în introducerea în grosimea stratului superior al pielii în suprafața plantară a membrelor posterioare într-o direcție la distanță de degete la articulația gleznei. Uneori folosit frecarea cu o spatula, virus care conține perie materiale în pielea scarfica a abdomenului, coapse, picioare, pieptene sau pene foliculi fluierul piciorului. Mușchiul coapsei, pieptului inoculat prin administrarea intramusculară. De multe ori, la șoareci, șobolani utilizate contaminare intraperitoneala, fixarea animalului cu susul în jos. Pentru infecție intravenoasă a șoarecilor, șobolanilor în vena laterală a cozii, cobaii - lângă procesul xifoid într-o regiune, iepuri - în vena marginală a urechii, păsări - în vena axilară este important să se controleze într-o venă din seringă nu au fost incluse bule de aer. Înainte de inoculare intranazală a animalelor (cu excepția iepurilor) pentru a evita strănut și împrăștierii de material conținând virus face anestezie cu eter profund. Contaminarea Intratserebrapnoe petrece mai puțin: șoareci albi, iepuri, porci de guineea - perforarea pielii și a craniului în zona marginii exterioare a orbitelor, șobolanii - printr-o gaură bavuri. În funcție de metoda de administrare și speciile de volumul dozei infectantă animal este determinat. Pentru animalele infectate după înregistrarea stabilită observarea zilnică a aspectului, comportamentul, mobilitatea, ingestia de alimente și așa mai departe. D. Moartea unele animale pot fi considerate ca fiind non-specific în prima zi.
Prezența virusului în materialul indică trei caracteristici: simptome ale bolii, modificări patologice și deces. Rețineți că datele nu sunt întotdeauna simptome atunci cand infectate, iar astfel de pasaje se numesc „orbi“. De exemplu, virusul conținut în materialul patologic de la un cal nu poate reproduce cu ușurință prima dată în corpul șoarecilor albi. În acest caz, o suspensie a materialului de la primul pasaj pentru a efectua repetate, uneori, în mod repetat, infectarea animalelor din aceeași specie.
Virusurile pentru care detecția și selecția folosind animale natural sensibile, nu necesită preadaptării și se manifestă în indicațiile specifice biotestare la primul pasaj.
Apariția modificărilor vizibile în starea și funcționarea organismului după infecția experimentală este considerată dovezi indirecte de replicare virală și indică faptul că organismul de testare conținea un virus. Luate în considerare în durata perioadei de incubare, care este caracteristică pentru o anumită boală. Adesea boala se termină cu moartea, care este, de asemenea, un semn de replicare virala in organism. Odată cu deschiderea modificărilor vizibile în culoarea, dimensiunea, forma, consistența de organe și țesuturi, de asemenea, indică replicarea virusului în organism. S-a obținut dintr-un material conținând virus animal reacționează cred izolarea virusului. Pentru a determina accesoriul specific al virusului trebuie să fie identificate prin teste serologice. Astfel materialul cu antigen necunoscut obținute la autopsie animal infectat.
Sub titrul virusului înțeleg expresia de concentrare a materialului. Titrul virusului - aceasta este cantitatea de virus conținută în unitatea de volumul materialului. Lucrarea virusologice în infecția experimentală sau producerea și evaluarea activității antivirale și a preparatelor de diagnostic adesea nevoie pentru a determina cantitatea de virus într-un anumit material. Cantitatea de virus este exprimată în unități de acțiune sau unități de activitate.
Și virusuri infecțioase au activitate hemaglutinantă. Prin urmare, unitatea de cantitatea de infecții virale și hemaglutinant. În practică, folosesc trei tipuri de cantități de unități de virus:
1. unități infecțioase de leziuni locale cauzate de virusuri și evaluate într-un singur efect.
2. unități infecțioase 50% din virusurile din sensibile obiectele vii măsurate. Static
3. Unități de hemaglutinare.
De la o deteriorare locală cauzată de viruși, cele mai cunoscute placi (insule moarte, nici celule colorate intr-un strat de viu colorată) în culturi de celule infectate, umplut neytralrot colorant agar și pockmarks (noduli necrotice) pe embrionii de pui hao infectate cu variola și alte virusuri .
Cantitatea de virus în acest caz, poate fi măsurat, respectiv, în unități blyashkoobrazuyushih (pfu) și unitățile ospoobrazuyuschih (ooe): = 1 doză pfu de virus care a cauzat formarea unei plăci; Ooe = 1 doză de virus care a cauzat formarea unuia pockmarks. Metoda de determinare a titrului virusului în ufc (ooe) este după cum urmează:
1. Volumele precis măsurate și strict identice de material care conține virusul a investigat infecta mai multe culturi de celule în baloane sau în embrioni de pui HAO.
2. Numarati plăcilor formate în fiecare saltea sau fiecare pocks embrion de pui.
3. Se calculează media aritmetică a numărului care este egal cu numărul de PFU de virus în ooe sau doză infecțioasă de material conținând virus.
4. Titrul viral (T) a fost calculat prin formula:
T = media aritmetică număr de plăci (pocks) / doză volum infecție x diluție de material conținând virus.
Se crede că banca se pretează la placi și pockmarks, în cazul în care numărul acestora nu este mai mare de 50 pe saltea sau Hao. Uneori, în cazul unei concentrații ridicate a virusului în plăcile materiale în culturi de celule sau pockmarks Hao pot fuziona, și nu pot fi luate în considerare. In astfel de cazuri, se prepară diluții de zece ori a materialului de testat și fiecare diluție inoculată în doze identice grupe egale de celule sau culturi de embrioni de pui, apoi se calculează media aritmetică a numărului de plachete sau pocks pentru fiecare diluție. Titrul virusului în acest caz se calculează după o formulă complicată:
T = numărul total de plachete aritmetice (pitting) în fiecare diluție / v infectând diluții doză x cantitatea de material care conține virusul
Metoda de titrare a virusului în ufc furnizează cele mai fiabile date cu privire la concentrația de virus, dar se confruntă cu dificultăți tehnice cu placi de numărare. În ceea ce privește corodare, utilizarea lor este limitată la relativ puține virusuri capabile să formeze noduli Hao embrioni de pui.
Această metodă este mai universal. Cantitatea de virus (titru viral), astfel, măsurată în doză efectivă de 50% - ED50.
1 ED50 = doza de virus care poate provoca efecte infecțioase la 50% din obiectele de test inoculate.
Pentru fiecare virus selectat susceptibil la obiectul testat - animale de laborator (șoareci, de obicei, alb), ouă de găină embrionate sau culturi celulare. efect virus infecțios sau efecte asupra sistemelor de testare diferite pot manifesta moartea, simptomele clinice și modificările efect citopatic pathoanatomical. La animalele de laborator și de embrioni de pui efect al virusului este estimat la doze letale și infecțioase:
1 LD50 - doza de virus care ucide 50% dintre animalele de laborator;
I ELD50 - doza de virus care ucide 50% dintre embrioni de pui;
1 ID50 - doza de virus care cauzează simptome clinice sau modificări patologice în 50% dintre animalele de laborator infectate;
EID50 1 - o doza de virus care determină modificări patologice în 50% din embrioni de pui infectate.
Intr-cultura de celule a virusului este evaluat prin efectul citopatic sau efectul (CPE)
TSPD50 1 - o doza de virus care produce efect citopatic în 50% din eprubete cu cultura de celule infectate.
Numărul ED50 (DL50 ELD50, ID50 și TSPD50 EID50) virus conținute într-o unitate de volum de material care conține virusul este un titru de expresie a virusului în acest material. Astfel, T înregistrare = 103.48 TSPD50 / 0,1 ml înseamnă că fiecare 0,1 ml de material care conține virusul este conținut 103.48 doze (3020), fiecare dintre care este capabil să inducă un efect citopatic în 50% din eprubete cu cultura de celule.
Unii viruși sunt capabili în anumite condiții, pentru a aglutina eritrocitele anumitor specii. Titrul acestor virusuri pot fi exprimate în termeni de gemagglyutiiiruyuschih (Gaya).
Gai = 1 doză de virus care poate aglutina 50% din eritrocite conținute în aceeași cu cea a virusului, cantitatea de suspensie 1% de eritrocite spălate.
Metodele de determinare a titrului virusului prin acțiunea hemaglutinarea este următoarea:
1) prepararea unei suspensii 1% de eritrocite spălate de la o specie de animal;
2) prepararea unei serii de secvențiale diluții în 2 de material care conține virusul în plăcile Plexiglas de testare în volume egale;
3) pentru toate diluțiile de material conținând virus, se adaugă o suspensie 1% de eritrocite spălate în aceeași cantitate;
4) amestecul este menținut timp fixat la o anumită temperatură și evaluată intensitatea gemagglyutiiatsii în fiecare (tub bine), în cruci. Că cea mai mare diluție de material conținând virus cu care aglutinează eritrocite 50% (nu mai puțin de două cruci), cuprinde 1 Gai.
Titrul virusului va fi majorat de mai multe ori, de câte ori este diluat materialul pentru a obține un 1 Gai. În cazul în care cea mai mare diluție a da hemagglutination două planuri transversale este de 1: 128, aceasta înseamnă că cantitatea de titrare a virusului, diluat de 128 de ori, conține 1 Gai. În acest caz, titrul virusului în materialul nediluat este de 128 Gai.
Proteine numite anticorpi produși în organismul animal cu sânge cald, ca răspuns la administrarea parenterală a substanțelor macromoleculare cu semne de heterolog genetice ale organismului. Substanțele care se formează anticorpi care administreaza sunt numite antigeni. Virusurile sunt copleșitor antigeni. Anticorpi capabili să reacționeze cu antigenul, ca răspuns la care au fost formate (specificitatea anticorpului) și neutralizează activitatea sa biologică. Astfel, anticorpii protejează organismul împotriva agenților infecțioși, aceasta este semnificația biologică a formării lor. Anticorpii pot interacționa cu antigene omoloage nu numai in vivo, dar in vitro.
Principiul constă în HAI faptul că in vitro volume egale mixte de ser și suspensie de virus și după expunerea pentru a determina dacă virusul în amestec este conservat prin adăugarea de suspensie eritrocit. Aglutinarea eritrocitelor indică prezența virusului în amestec. Absența hemagglutination înseamnă că virusul este neutralizat de anticorpi și, prin urmare, a pierdut capacitatea de a aglutina eritrocitele.
Dar anticorpi față de antigene interacționează într-un mod strict determinate raporturile cantitative. Prin urmare, într-o anumită cantitate de virus a fost capacitate de hemaglutinare lipsită, necesită un anumit anticorpi minim, precum și una dintre componentele HAI întotdeauna necunoscute, este necesar pentru a pune reacția într-o serie de eprubete cu doze diferite ale acelorași anticorpi și doze de virus sau invers. Acest lucru se realizează prin faptul că acestea iau sau diferite diluții ale serului și aceeași diluție de virus sau diferite diluții ale virusului și aceeași diluție de ser.
HIT următoarele sarcini:
- determina titrul anticorpilor virusului în gemagtlyutiniruyuschemu din ser;
- gemagglyutiniruyushy identifica un virus necunoscut din serul cunoscut;
- pentru a stabili gradul de înrudire antigenic al celor două virusuri.
Avantajele HIT: tehnica simpla, rapida, nu necesita lucru steril, specificitate, cost redus. Dezavantaj: HI este posibilă numai cu viruși gemagglyutiniruyushimi.
Principiul titrarea anticorpilor la HIT este după cum urmează:
- pregătirea unui număr de (de obicei de 2 ori) diluții succesive ale serului în volume identice (castron 0,25 sau 0,2 ml);
- fiecare diluție a fost adăugat același volum de virusul omolog la un titru de 4 Gai;
- amestecul se menține o anumită perioadă de timp la o anumită temperatură (pentru virusul bolii Newcastle 40-60 min la temperatura camerei);
- toate amestecurile a fost adăugat un volum egal de 1% suspensie de globule roșii spălate;
- după expunerea este evaluată hemaglutinare în fiecare amestec de cruci.
Reacția prevede controlul de ser, virus și eritrocite.
Cea mai mare diluție de ser care încă inhibă complet gemagglyutinaiiyu. Este luat ca o indicație a titrului de anticorpi în ser.