Pentru o acumulare cantitativă de viruși sunt sistemul cel mai convenabil de cultură celulară. Primele încercări de cultivare în celulele animale in vitro aparțin la sfârșitul secolului trecut. Aceste observații fragmentare au indicat că posibilitatea de a salva viabilitatea in vitro a țesuturilor și a celulelor și a marcat începutul unei cercetări culturi tisulare profunde.
O mare parte a creditului în tehnici de cultură de țesut pazrabotki aparține Carrel El a demonstrat mai întâi posibilitatea de propagare a celulelor animale in vitro și, astfel, au demonstrat lor „nemurirea“ și asemănarea cu organismele care trăiesc liber unicelulare. progrese semnificative în această direcție a ajuns la un grup de cercetători sub conducerea lui Earl. Ei au primit mai întâi un număr mare de creștere celulară pe sticlă și se agită în suspensie lichidă. Apariția de antibiotice și progrese în crearea de medii de cultură artificiale a deschis o nouă eră în dezvoltarea de metode de cultură de țesut.
Cultura de țesut pentru o lungă perioadă de timp au fost folosite pentru a aborda diverse aspecte ale biologiei și medicinei. Cu toate acestea, numai progresul în domeniul virologie, realizat cu ajutorul culturii de țesut, cu condiția ca un stimul puternic pentru dezvoltarea lor la zi.
Cultivarea de viruși ajută pentru a rezolva o serie de aspecte teoretice legate de studiul interacțiunii dintre „celulă-virus“. Pe lângă soluția unui număr de aplicații asociate cu diagnosticul si producerea de medicamente pentru prevenirea infecției virale este imposibilă fără acumulare de materie primă care conține virusul.
Tipuri de culturi celulare.
Transferul întregului organism in celule in conditii vitro vii încetează să mai existe ca una din mai multe componente structurale ale țesuturilor sau organelor la care au fost anterior. Astfel, ieșirea din celulele neuronale de control și factorii umorali dobândi o serie de caracteristici care depind atât pe faptul respingerii celulelor din aceste țesuturi precum și condițiile particulare ale existenței lor in vitro.
Organism viu este țesuturi sau celule sunt caracterizate printr-un complex metabolice, trasaturi morfologice si genetice, in mod dramatic diferite de proprietățile organelor și țesuturilor din celulele vivo.
În funcție de metoda de tesut explante primare si cultura aceasta arta sunt mai multe tipuri de supraviețuire și creștere culturi de țesuturi și celule. Cele mai comune sunt un singur strat, precum și culturi în suspensie de celule în creștere. Ele constituie fundamentul practicilor moderne de laborator virusologie și de fabricație.
Există două tipuri principale de culturi de celule monostrat: primare și continue.
Termenul „primar“ se referă la cultura celulară obținută direct din țesuturi umane sau animale în embrionare sau postnatale. Durata de viață a acestor culturi este limitată. După un anumit timp ele apar fenomene degenerare nespecifice, rezultând în granulare și vacuolizare citoplasmatică, rotunjirea celulelor, pierderea de comunicare dintre celule și substratul solid pe care au fost cultivate. schimbarea periodică a mediului, o schimbare în compoziția acestuia, precum și alte proceduri pot crește doar ușor termenii culturii de celule primare a vieții, dar nu poate împiedica distrugerea ei finală și moartea. După toate probabilitățile, acest proces este asociat cu dispariția naturală a activității metabolice a celulelor derivate din controlul factorilor neuro-umoral care acționează în întregul organism.
Numai celule individuale sau grupuri de o populație de celule în fundal cea mai mare parte a stratului degenerare celulară poate păstra capacitatea de a se reproduce și crește. Aceste celule, dezvăluind potenta multiplicare infinit in vitro, prin inoculare repetată da naștere unei culturi continue a celulelor.
Distinge linii și tulpinile transplantate celule. Primul termen se referă la celule transplantate, caracterizat potențial nemuririi și al doilea termen cariotipului obicei heteroploid - celule poluperevivaemye cu un cromozom diploid set si durata de viata limitata in vitro. Apariția celor și a altor celule asociate cu procesul de selecție în populația celulară a culturilor primare, care sunt astfel sursa tuturor liniilor si tulpini de celule transplantate.
Principalul avantaj al liniilor celulare continue, în comparație cu orice cultură primară, este nelimitată potenta de reproducere in vitro și autonomia relativă le face similar cu bacterii și protozoare unicelulare.
Capacitatea celulelor transplantate la proliferarea fara sfarsit in vitro marchează un salt calitativ în care celulele dobândesc capacitatea de a existență autonomă, cum ar fi microorganismele crescute pe mediu nutritiv artificial. Un set de modificări care duc la apariția celulelor astfel de facilitate, numita transformare, iar celulele de cultură de țesut transplantat - transformat.
Imbunatatirea tehnicilor de culturi celulare extins foarte mult posibilitățile de linii celulare continue dintr-o largă varietate de animale și țesuturi umane. Atunci când acest lucru nu a fost găsit în limită de vârstă, peste care țesutul s-ar pierde capacitatea lor de a se adapta la o creștere nerestricționată in vitro, adică, la transformare.
O altă sursă de linii celulare continue sunt tumori maligne. În acest caz, transformarea celulelor are loc in vivo ca rezultat al procesului patologic a cărui etiologie este încă în mare măsură neclar.
Nu toate tumorile maligne sunt în măsură să dea naștere unei culturi celulare continue. Astfel, de exemplu, au fost încercări nereușite de a primi celulele transplantate de la cancerul de stomac și de sân uman. Mi se pare că este dificil să se adapteze la viata in celulele in vitro de cancer cu celule scuamoase al pielii și mucoaselor. Pe de altă parte, este linia de ieșire relativ ușor de sarcoame de țesuturi și tumori maligne ale sistemului nervos.
Mediu.
În orice cultură celulară distinge celulă și o fază lichidă. Faza lichidă asigură funcțiile vitale ale celulelor și cultura este un mediu de cultură de compoziție diferită și proprietăți.
Toate mass-media în scopul preconizat să fie împărțită în creștere și sprijin. Compoziția mediilor de creștere ar trebui să conțină mai multe elemente nutritive pentru a asigura proliferarea activă a celulelor pentru a forma un monostrat pe o suprafață de sticlă sau o concentrație suficient de mare a elementelor celulare în suspensie (în prepararea culturilor în suspensie). mediu de sprijin ar trebui să ofere o experiență de fapt, numai celulele deja formate în monostrat de celule atunci când propagate agenți virali.
Creștere și susținerea mass-media multicomponent. Structura acestora poate include atât produse naturale (lichid amniotic, animal ser) și substraturi obținute prin prelucrarea parțială a produselor naturale (extracte embrionare, lactalbumină, hidrolizatul gemogidrolizat, aminopeptid și t. D.) și sintetice chimic substanță pură (aminoacizi, vitamine, săruri).
Ca un exemplu de mediu nutritiv, care constă în întregime din ingrediente naturale, acesta poate fi numit mediu Buckley propus pentru cultivarea culturilor celulare de maimuță epiteliului renal. In acest mediu vaca intră amniotiche-lic lichid (85%), ser de cal (10%) și extract bovin fetal (5%).
Toate produsele malostandartny naturale, utilizarea lor este asociată cu un risc ridicat de contaminare bacteriene și virale de culturi celulare. În legătură cu aceasta, există o deplasare treptată a amestecurilor lor standard de sinteză. Cele mai utilizate pe scară largă sunt mediu sintetic 199 și Dulbecco. media utilizate în mod obișnuit care conțin cantități bine definite de săruri, aminoacizi și vitamine.
Indiferent de toate-scop nutritiv pentru mediile de cultură de țesut sunt construite pe baza unei soluții de sare echilibrată cu o capacitate tampon suficientă. Cel mai adesea, acestea sunt soluțiile Hank și Earl. Aceste soluții - o componentă necesară a oricărui mediu. O componentă esențială a majoritatea mediilor de creștere este ser animal (bovine, bovine, cal), fără prezența de 5-10%, care are loc multiplicarea celulară și formarea monostratului.
Includerea serului în același timp împiedică crearea compoziției chimice exacte medii de creștere este foarte importantă pentru dezvoltarea cercetării fundamentale asupra fiziologiei celulare, ca și cu ser (sau derivați ai acestuia) a introdus un set de factori necontrolabili, variază în funcție de serul seriei.
În 50 și Ewans Waymouth a fost oferit fara ser compoziția chimică exactă. Cu toate acestea, aceste medii nu asigură activitatea proliferativă performanța celulelor, care provoacă mediu suplimentat cu ser. În legătură cu această lucrare este de interes și Birch Pirt, arătând că pentru o creștere intensivă a celulelor în mediu liber de ser, determinare este de a include sulfați de Fe, Zn, Cu, și MnS12.
Mediul nutritiv de creștere, precum și soluția tampon pentru spălarea țesăturilor adăugate antibiotice. Ele sunt administrate în mediul imediat înainte de utilizare rată de 1 ml soluție stoc per 500 ml de mediu de antibiotice.
Mai jos este o compoziție și metodă pentru prepararea uneia dintre mediile nutritive cele mai comune.