Funcția primară a ADN-ului este capacitatea sa de a auto-dublare (replicare). Replicarea - un mecanism foarte precis, aproape nici o greșeală. ADN-ul în sine (în unele virusuri - ARN) codificate informații privind structura enzimelor implicate într-o dublare a acizilor nucleici, sinteza de noi nucleotide - replicarea bazei de date de construcție, corectarea erorilor de replicare, precum și repararea daunelor ADN-ului cauzate de diverși factori. În final, structura ADN-ului în sine, și anume prezența a două lanțuri în structura sa, este o condiție prealabilă pentru facilitarea procesului de copiere, ca și în acest caz, fiecare dintre lanțurile pot servi ca matrice pentru sinteza de noi molecule de ADN. O astfel de ipoteză este exprimat, James Watson și Frensis Krik în 1953 și a primit confirmarea experimentală. O astfel de mecanism de copiere ADN, atunci când fiecare din circuit îndeplinește funcția de șablon și moleculele nou sintetizate sunt hibride (care constă dintr-un vechi și un lanț nou), numit semi-conservatoare.
Pe lângă semiconservative sa oferit alte doua modele de replicare: conservatoare și de dispersie. Caracteristicile acestor modele de replicare a ADN sunt după cum urmează. Conform modelului de dispersie helix ADN parental este rupt prin dublarea la fiecare jumătate de tură prin fragmentare multiplă și sinteză a lanțurilor noi apare pe fragmente (fig. 1.9). Conform modelului conservator al ADN-ului helix nu unwinding se întâmplă la toate, și servește ca un șablon pentru cele două noi circuite, provocând helix-mamă constă în întregime din vechi, și o filială deținută în întregime - a noului material. Mecanismul de realitate semiconservative replicarea ADN-ului Proof furnizat Meselson, Steel în 1958, în experimentele de ultracentrifugare cu ADN-ul bacterian marcat.
Esența acestor experimente a fost următoarea: ADN marcat cu E.coli radioizotop 15 N, iar apoi a fost lăsat să se materializeze o rundă de replicare a ADN-ului, creșterea celulelor pentru
50 min într-un mediu nutritiv conținând izotop normal de azot - 14 N. izolat ADN-ul din celulele a fost supus la ultracentrifugare într-un gradient de densitate de clorură de cesiu. Cu astfel de molecule produc o centrifugare CsCl într-un tub cu gradient de densitate, și moleculele altor substanțe care sunt distribuite într-un gradient în funcție de densitatea lor. ADN-ul E. coli, crescute pe un mediu care conține 15 N, are o densitate de 1,724 g / cm3, în timp ce ADN-ul celulelor crescute pe un mediu convențional cu izotop 14 N, are o densitate de 1.710 g / cm 3. Astfel, amestecul acestor două tipuri ADN-ul a fost ușor de separat prin centrifugare la densitate. Localizarea ADN-ului într-un tub de testare cu gradient de CsCI poate fi determinată prin absorbție UV (ADN absoarbe radiațiile cu o lungime de undă de 260 nm). Astfel, ADN-ul este detectat in vitro sub formă de „dungi“ - „light“ la marginea superioară a tubului, „grele“ - este mai aproape de partea de jos. In acest experiment, in vitro, cu un gradient de clorură de cesiu format este doar una, media band „gravitate“ a cărei poziție corespunde cu ADN hibrid conținând izotop doi azot - 15 N și 14 N. Acest fapt exclude posibilitatea de a implementa un singur ADN model de replicare -konservativnoy. Pentru a selecta între celelalte două modele de replicare Meselson, Steel a permis bacteriilor a caror ADN conținea ambii izotopi, pentru a face încă o altă diviziune în mediu cu 14 N. Apoi, ADN-ul lor a fost supus din nou ultracentrifugare. In acest moment, in vitro, ADN-ul format două benzi - cel „ușor“ și media „gravitate“, ceea ce confirmă validitatea mecanismului de replicare ADN-ului semiconservative.
Deci, toate învățat de acum cum replicarea acizilor nucleici sunt reduși la mecanismul de semi-conservatoare, prin care, după fiecare rundă de replicare, un fir în fiecare dintre cele două molecule fiice este părintele, adică conservator, iar celălalt - .. Sintetizat din nou. Replicarea acid nucleic mono sau dublu catenar, care reprezintă gene de organisme diferite, se efectuează în anumite regularități în punerea în aplicare a diferitelor mecanisme, care sunt discutate mai jos. Comun tuturor acestor procese este: 1) o parte un set complex de enzime care efectuează replicare; 2) prezența a trei etape principale ale procesului - inițiere, elongare și terminare; 3) respectarea principiului complementarității în construcția lanțurilor noi, în care modelul (matrice) servește ca catena părinte; 4) de înaltă precizie a procesului; 5) posibilitatea de a corecta erorile de replicare în timpul corectură.
Replicarea ADN-ului dublu catenar. ADN dublu catenar formează genomul tuturor organismelor celulare - și procariote și eucariote. Ei bine, replicarea ADN-ului a fost studiat cu privire la celulele procariote, în special bacterii E. coli. In experimentele cu procariote arătat că, în condițiile care limitează sinteza proteinelor, replicarea ADN-ului nu se produce, de la care se poate concluziona că acest proces necesită participarea proteinelor. A fost acum demonstrat că produsele implicate in mai mult de 10 de gene în procesul de replicare a ADN-ului. Aceasta este, în primul rând, ADN polimeraza. și topoizomeraza. helicazei și ligases. Există tot mai multe dovezi pentru a sprijini participarea la procesul de replicare a ADN-ului este extrem de organizat -replisomy multienzimatic complex. format-praymazny primosome complex, helicaza, Pol III-holoenzimă și girază.
polimeraza ADN - o cheie de procese enzima replicative care de fapt efectuează lanțuri polinucleotidice capacitate principiul complementarității folosind. Cel mai complet studiat ADN polimerazei de E. coli. In celulele bacteriilor am gasit trei tipuri diferite de ADN polimeraze (Pol-I, Pol-II si Pol-III), care diferă în primul rând în rata activității nucleazei cataliză și. ADN-polimerazei I (Pol-I) este o singură polipeptidă care cuprinde aproximativ 1000 de resturi de aminoacizi. In celulele de E. coli, există aproximativ 400 de molecule ale enzimei. Pol-I are următoarele activități: polimeraze - îmbinare dezoxinucleotidele complementare la catena matriță la un grup liber 3'-OH a primerului în direcția de la 5'- la capătul 3 '(5 „→ 3“) fiind construit molecula de ADN; exonucleazică - hidroliza legăturilor fosfodiesterice (clivaj de nucleotide) într-o singură catenă de ADN sau sfârșitul neasociat ADN duplex, deoarece circuitul 3ў-end (3 „→ 5“) și capătul 5 'al lanțului (5 „→ 3“). exonucleazică joacă un rol important în replicarea și repararea ADN-ului cromozomial de E. coli. 3 „Activitatea → 5'-exonuclează asigură un control pentru fiecare adăugare de nucleotide și de deleția eronate capăt de lanț în creștere nucleotidă (corectură) și 5“ → activitate 3'-exonuclează este utilizat pentru a îndepărta dimerii și pirimidină ribonucleotide fragmente Okazaki.
ADN-polimerazei II (Pol-II) este prezent în celulele Escherichia coli in mod semnificativ mai puține copii și efectuează activitatea de polimerază sunt mult mai lent decât Pol-I (reprezintă doar 5% din activitatea ADN-polimerazei I). Spre deosebire de Pol-I, această enzimă nu are activitate 5 „→ 3 'exonucleazică. Rolul acestei replicare polimerazei nu este pe deplin înțeles. Se crede că această enzimă nu este necesară pentru replicarea ADN-ului, dar poate înlocui funcția individuală Pol-I, atunci când acesta este deteriorat.
ADN-polimerazei III (Pol-III) - principala enzimă responsabilă pentru replicarea ADN-ul cromozomial al E. coli. Fiecare celulă conține numai 10-20 molecule acestei enzime, dar ruleaza aproximativ 60 de ori mai rapid ADN polimerazei I. Mai mult, Pol-III are o afinitate mai mare pentru matrice și oferă o copiere de înaltă eficiență. Pentru această enzimă, precum și pentru Pol-II, nu este inerentă activității 5 „→ 3'-exonuclează. Prin urmare, replicarea circuitului pentru Pol-lagging I necesită participarea să aibă loc îndepărtarea primerilor ARN la capătul 5 'al fragmentelor Okazaki.
În celulele eucariote, a relevat un număr mai mare de ADN polimeraze, dar funcțiile lor sunt examinate mai rău.
Funcția topoizomeraza este de a rezolva problemele mecanice și topologice în procesul de derulare dublu helix la bifurcație de replicare. Aceste enzime modifica gradul de supercoiling și conduc la formarea unei „balama“, care creează condițiile pentru deplasare continuă a furcii de replicare. În diferite organisme identificate topoizomeraza două tipuri principale: tipul I al topoizomerazei incizată unul dintre cele două lanțuri, în care porțiunea de capăt a dublului helix se poate transforma în jurul valorii de lanturi intacte, iar apoi capetele tăiate reunirii ale lanțului. Topoizomerazei făcând pauze temporare în ambele catene complementare modifică gradul de supercoiling, și apoi conectați capetele rupte.
Helicazei efectuat formarea și avansarea de-a lungul unei helix replicarea ADN-ului furcii - porțiunea detorsiunii cu lanțuri de molecule. Aceste enzime sunt folosite pentru energie lanțuri detorsiunii eliberată prin hidroliza ATP. Pentru a asigura o mai mare viteză de derulare a mai multor helicases funcționa împreună cu un al doilea tip de proteine care se leagă la porțiuni mono-catenare ale moleculei și prin aceasta stabilizează duplex unwound.
In final, ligaza ADN catalizată fragmente procesele de reunire ADN-ului, care participă la formarea de legături covalente (poduri) fosfodiesterice între 3'-OH grupe de dezoxiribonucleotidică adiacent 5'-P- și. Aceste enzime folosesc energia ca legătură bogată în energie, format prin hidroliza ATP sau GTP.
Alungirea replicarea ADN-ului. Sinteza noilor spiralele ADN se efectuează în conformitate cu principiul complementarității: Selectat din fiecare lanț de nucleotide care să fie în creștere complementară (matrice) circuitul corespunzător (situat vizavi) în nucleotida originală.
Deoarece toate polimerazele ADN efectuat nucleotide proces de polimerizare într-o singură direcție (5 „→ 3“) și se deplasează de-a lungul furcii de replicare a ADN-ului în ambele direcții, sintetizate în mod continuu, în fiecare dintre zonele poate doar un singur fir, numit de conducere. A doua (opusă) catena este sintetizată în fragmente scurte (fragmente Okazaki) și se numește rămînerii (Fig. 1.10). fragmente Okazaki de procariote conțin aproximativ 1000 nucleotide și în eucariotele - 100-200 nucleotide.
În plus lanțuri de polimerizare care se efectuează în principal ADN polimerazei III, replicarea ADN-ului în timpul următoarelor evenimente apar:
- tăierea primerilor cu lanț ARN din conducând la și de la fiecare dintre fragmentele Okazaki. Această funcție face Pol-I prin activitatea sa de 5 „→ 3'-exonuclează;
- umplerea „lacunele“ rămase din tăierea ARN primers. Această lucrare oferă, de asemenea, ADN-polimerazei I, folosind liber gruparea 3'-OH fragment Okazaki adiacent;
- unește fragmentele de ADN în catena lagging de ligaza ADN enzimatic, în creștere capătul 3'-hidroxil a fiecărui fragment Okazaki ajunge la capătul 5 'al unui rest deoxinucleotide vecin este eficient ADN ligază și format de circuit lagging continuu;
- corectarea erorilor de replicare - corectură. Acest mecanism este caracteristic pentru Pol-I, iar pentru Pol-III și se bazează pe activitatea lor 3 „→ 5'-exonuclează. Este cunoscut faptul că ADN-ul polimerazei verifică complementaritatea nucleotidă ales controlul dimensiunii prezumată a noilor perechi de baze în centrul său activ și activitatea de polimerază este activată numai când acest set complementar. Pe de altă parte, fiecare nucleotidă nou introdus este, de asemenea, verificat pentru conformitatea cu perechea sa în situsul activ al enzimei. Dacă dimensiunea perechii de bază rezultată nu corespunde adevăratului (când nucleotidele de bază opuse nu sunt complementare între ele), prin activitatea 3 „→ 5'-exonucleazei enzima secționează și un căutări de nucleotide non-complementare pentru un înlocuitor. Un mecanism suplimentar care reduce erorile de replicare, repararea ADN-ului este. Ca urmare, frecvența incorporare eronate a nucleotidelor în rezultat replicarea catenei ADN este extrem de redusă (10 -8 -10 -10).
Replicarea Terminatsiya. Când bidirecțională replicarea genomului inel (ca în E. coli), replicarea furcii se întâlnesc la o distanță de 180 ° din punctul de replicare și replicare în acest punct se termină. Inelară ligaza DNA a intrat în locul de întâlnire, și ele sunt interconectate reciproc, și mai departe ele sunt separate în genomul individuale prin topoizomeraza II.
Rata de replicare a ADN-ului in bacterii este de E.coli aproximativ 1500 de perechi de baze pe secundă. Astfel, genomul complet de Escherichia coli (4 x 10 6 alin. N.) replicată în aproximativ 40 minute. Cu toate acestea, celulele diviza rapid E. coli - la fiecare 20 de minute, ceea ce înseamnă că crește frecvența actelor de inițiere în același punct de origine de replicare la aceeași viteză de copiere. E. Înainte de finalizarea primei runde de replicare a genomului site-ului ori în a doua rundă de replicare este inițiată. Viteza de deplasare a furcii de replicare în celulele eucariote este semnificativ mai mică (10-100 bp pe secundă), dar finalizarea replicare într-un timp rezonabil, este asigurată prin inițierea simultană la o multitudine de puncte. Ca rezultat, cromozomul Drosophila, de exemplu, conținând 6,5 * 10 bp iulie replicat în câteva minute.
In general, modelele de replicare identificate pentru procariote, de asemenea, caracteristice majorității genomilor eucariote. Diferențele sunt, în primul rând, în prezența unei multitudini de situsuri de inițiere replicare eucariotici pe fiecare cromozom, altele decât cele ale procariotelor, mecanisme pentru a corecta erorile de replicare, precum și echipamentul enzimatic al procesului de replicare. Reprezentarea schematică a procesului ciclic de replicare care formează genomi și plasmide procariote și genomurile liniare (eucariote) sunt prezentate în Fig. 1.11.
ADN-ul liniar unwinding lanțurile se realizează prin rotirea în jurul unul pe altul lanț. ADN-ul circular unwinding și replicarea conducă la formarea unei structuri asemănătoare cu un inel cu o buclă internă. Se numește theta-bucla. deoarece forma este similar cu litera Q. grecească Aceste bucle pot fi văzute în autoradiografia replicarea ADN-ului bacterian, efectuat pentru prima dată la DNA Cairns E. coli. Mecanismul de mai sus de replicare a ADN-ului bidirecțională este cel mai frecvent, dar nu singurul. fagi ADN P22, 186, P2, și fagul T4 și l în etapele ulterioare ale ciclului litic mecanismul purtător replicată (tip cerc de rulare). In acest caz, un ADN dublu catenar circular incizie enzimă specifică la un situs unic într-un singur lanț (punctul de pornire al cercului de rulare). Notch rezultată capătul 5 'al catenei este legat de o enzimă efectuată incizie. sinteza ADN începe cu capătul 5 'al deplasării asociate cu enzima în soluție, permițând ADN polimerază pentru a atașa nucleotide la capătul 3'-OH. replicare Semiconservative are loc în care capătul 5 'al lanțului rupt este deplasat ca coada liberă și toate creșterile sale de lungime, în timp ce matricea servește ca un circuit închis este intact. Această structură replicativ (fig. 1.12) se numește inel de rulare, deoarece unwinding lanțului monocatenară liber este însoțit de matricea de rotație în jurul axei sale.
Dacă acest mecanism este utilizat pentru replicarea ADN dublu catenar, cozile 5'-terminale servesc ca șabloane pentru sinteza fragmentelor de ADN mici, care imediat cusute împreună cu ADN ligaza. Ca urmare a cozilor în creștere la scurt timp după formarea sa dobândi o structură dublu-catenară. cozi elongație, uneori, duce la
că lungimea lor totală este de mai multe ori o lungime a moleculei circulare originale. O astfel de metodă de replicare, folosind, de exemplu, fagi l. Când ambalajul ADN-ul in capsids in zone speciale numite cos-uri și distanțate de lungimea genomului viral sunt formate prin crestături, duplexurile lungi se repetă în mod repetat un fragment de ADN fagic în fragmente care corespund dimensiunilor ADN mature detectate în virioni l bacteriofag . replicare cerc Rolling este caracteristic pentru formarea copiei cromozomului bacterian Hfr și factorul de E. coli F +. transmisă conjugarea într-o celulă recipient.
Replicarea ADN monocatenar. La fagii sau fH174 M13 caror genom sunt prezentate singur replicarea ADN-ului circular matur se realizează prin mecanismul cerc de rulare (Fig. 1.12). Acest lucru se întâmplă în etapele ulterioare ale infecției, după
infecțios ADN dublu catenar este transformată într-o formă inelară. În acest caz, nu replicare se realizează porțiuni 5'-end, spre deosebire de gene de replicare a fagului l (Fig. 1.12, poz. 5), astfel încât produsele de replicare sunt lungi de ADN singur fir, care separă în mod continuu de la „role de rulare“ Aceste circuite fiecare incizat originea replicării și închisă pentru a forma un inel forme mature ambalate în capside.