Granzimă B, o familie de serin proteaze, sunt exprimate în mod exclusiv de către limfocitele T citotoxice si celulele normale killer (NK), componente ale sistemului imunitar, care protejează organismele superioare de infecție virală și transformarea celulară. După contactul mediat de receptor între celula care conține granmiame și celula țintă infectată sau transformată, granmiamele sunt introduse în celula țintă prin endocitoză și induc apoptoza. Granzyme B este cel mai puternic inductor al apoptozei din familia granzymelor. Ca și caspazele, proteazele cisteinice, care joacă un rol important în apoptoză, pot rupe proteinele de-a lungul reziduurilor acide, în special acidul aspartic. Alte granmiame pot efectua funcții suplimentare, iar unele nu pot induce apoptoza. Granzymele sunt bine studiate numai la oameni și la rozătoare și pot fi combinate în trei subfamilii cu specificitate substrat:
- granmiamele cu activitate enzimatică similară cu chymotripsina, codificate de un grup de gene "locusului chimic";
- granmiame cu specificitate asemănătoare tipului de tripsină, codificate de "locusul triptazei";
- iar a treia subfamilie se desprinde după reziduuri hidrofobe nerodificate, în special metionină, și este codificată de "locusul meta-ase".
Toate granzimele sunt sintetizate ca proenzime și, după scindarea peptidei leader și îndepărtarea dipeptidei de la capătul N-terminal, se obține activitatea enzimatică maximă. Toți aceștia pot fi blocați de inhibitori serinici ai proteazei și recent a fost identificat un nou grup de inhibitori - serpini, dintre care unii sunt specifici pentru granmiame. Studiul viitor al serpinelor poate clarifica modul în care celulele care sintetizează granmiamele sunt protejate de apoptoză.
Geneza organizării și evoluției
„granule Enzime“ sau „granzymes“ [1] constituie circa 90% în greutate din granule citolitice ( „secretoare“ lizozomi specializate) limfocitele T citotoxice (CTL) și celulele killer normale (NK). Granzymes structural chimotripsina înrudite, resturi cheie triadă - histidină, acid aspartic și serin în centrul catalitic și este legată genetic cu alte leucocite serin proteaze, în special monocite și celulele mast. Toate cele opt granzymes (A-G și M) au fost identificate la soareci, dar numai cinci cunoscute persoanei cu (A, B, H, M și triptază 2, de asemenea, cunoscut sub numele de granzimă 3). La om, echivalentele cu granzimele de șoarece C-G nu sunt cunoscute, iar granzima H este caracteristică numai oamenilor (tabelul 1).
Toate genele granzymes organizate într-un mod similar și transcrierile acestora sunt formate din cinci exoni, dintre care prima codifică o secvență lider, în timp ce exonii 2, 3 și 5 codifică aminoacizi individuali ai triadei catalitice (Figura 1). Deși cele mai multe alte gene granzyme codifică doar o transcripție, cele două mRNA ale granzimei A sunt rezultatul unei îmbinări alternative a diferitelor exoni.
Studiile de cartografiere gena indică faptul că cele trei granzymes subfamilie umane și de șoarece corespund cu trei locații corespunzătoare, cu fiecare subfamilia având propria sa specificitate de substrat larg (Tabelul 2). Rezultatele cartografierii genelor de șobolan nu sunt încă disponibile. Genele care codifică granzimă A uman (HFSP) și triptaza 2 (TRYP2) cartografiată pe cromozomul 5q11-q12 [2]. Granzimă B și genele H mapat într-un grup de serin proteaze la 14q11, care cuprinde o genă pentru proteaza catepsina G, care este specific pentru celulele mieloide [3]. gena granzimă M situată aproape de gene care codifică azurotsidin (Azu), elastaza neutrofile (NE) și proteinaza-3 (PR3) la cromozomul 19p13.3 [2,4]. La șoarece, respectiv - cromozomul 10 pentru granzima A și alte triptază, 14D (granzymes pentru B-F) și 10C (pentru granzima M, AZU și NE).
In general, granzymes subfamilie sunt, respectiv (Tabelul 2) tripsină-like, chimotripsina-like și elastaza ca și specificitatea și genele lor sunt grupate în loci "triptază", "chymase" și "Met-ază" [4]. Aceste clustere genetice au unele particularități. De exemplu, șoarece și genele umane granzimă M, AZU PR3 și fiecare are intronul 1, localizată între secvența resturilor -6 și -7 lider, indicând relațiile evolutive apropiate. La om, genele care codifică granzymes B și H și catepsina G sunt strâns legate, fiind amplasate în 50 kb în afară. gena granzimă H este situat intre doua alte gene și poate fi apărut ca un „hibrid“, primele trei exoni și introni genei granzimă B și cealaltă porțiune de capăt a genei serin proteazei. Apariția unui hibrid ar putea fi obținută prin acumularea de mutații punctuale.
Șoarece, șobolan și B uman granzymes conțin aproximativ 70% resturi identice, în timp ce granzymes din oricare dintre subfamiliei (de exemplu granzymes B și C la șoarece) sunt similare la 55-70%. Similaritatea secvențelor de aminoacizi este redusă la aproximativ 30-40% atunci când se compară diferitele subfamilii ale granzymes, cum ar fi granzimă A și B granzimă (37%), chiar și în cadrul aceleiași specii. Deși granzymes, probabil, exista in diferite specii care au dezvoltat un sistem imunitar (de exemplu, păsări), acum, din păcate, granzymes secvență definită doar la mamifere.
Ca și alte serine proteaze, activitatea catalitică a granzimelor este determinată de restul de serină din situsul activ, una din triadele resturilor His57, Asp102 și Ser195 în chimotripsină [4]. Ei au, de asemenea, un buzunar de oxidare pentru stabilizarea stărilor intermediare ale complexului enzimă-substrat și un buzunar de legare la substrat, a cărui formă determină specificitatea proteazei. Recent, structura cristalografică a granzimului B de șobolan a fost determinată [5]. Structura cristalului a prezentat mai multe surprize. Se demonstrează că fanta substratului de granzimă B este destul de spațioasă și pot fi localizate aici câte opt reziduuri de substrat. Reziduul cheie pentru contactul cu restul de substrat P1 (aminoacidul care este situat în apropierea legăturii scindabile în direcția N-terminală, de obicei acidul aspartic) este Arg226 (Figura 2).
Granzymele sunt sintetizate ca proenzime care se maturează în timpul ambalării în granule citolitice. După scindarea peptidei lider sunt doi aminoacizi, legate cu secvența matură de aminoacizi care sunt mai târziu dipeptidylpeptidase tăiat I (DPPI, de asemenea, numit catepsina C), exprimat în peptidazei constitutiv lizozomi [6]. Granzimele devin active catalitic numai după ce dipeptida amino-terminală a fost scindată; pH optim de aproximativ 7,5 până la granzymes, deci maxim activ, atunci când este eliberat din granulele secretorii în citoplasmă (valoarea pH 7). DPPI - un regulator cheie granzymes funcții și granzymes șoareci DPPI cu deficit de activitate este redusă sau inexistentă. Expresia granzimelor imature în celulele lipsite de DPPI are ca rezultat formarea unei proteine granzime inactive. Granzymele pot fi exprimate în astfel de celule dacă dipeptida activatoare este îndepărtată.
Granzimele A și B sunt furnizate cu molecule de manoză-6-fosfat pentru ambalarea receptorului manoză-6-fosfat [7], același pentru granmiame și oameni, și pentru rozătoare. Partea mai mica a granzymelor este ambalata cu manoză-6-fosfat independent. Granzimele suferă de asemenea o glicozilare N-terminală neconstantă. Granzyma C de șoarece are câteva reziduuri glicozilate, în timp ce într-un alt caz, jumătate din greutatea moleculară a granzimelor D este carbohidrații incluși în cinci puncte. Granzymele sunt similare cu alte enzime asemănătoare cu chymotrypsin, dar au și unele caracteristici. Reziduurile din pozițiile 1-4 (de obicei, Ile-Ile-Gly-Gly) și 9-16 sunt foarte conservate în toate granzimele, atât la oameni, cât și la rozătoare. Secvența lor dipeptidă este de obicei Gly-Glu sau Glu-Glu. Ei au trei legături disulfidice conservatoare, deși granzymele A și M și triptaza-2 au patru. Granzyme A este singura granzyme care este un dimer datorită punților disulfidice intermoleculare.
Localizarea și funcția
Expresia granzymes limitate de limfocitele T activate, celulele T imature în timus (timocitelor), o populație mică de kletkok T specializate detectate in principal in intestin si ucigasi normali. Dintre acestea, celulelor NK și celulele T ale intestinului sunt în mod constant producă și să acumuleze granzymes, în timp ce limfocitele T produc ARNm și lanțuri proteice granzymes trebuie indusă prin expunerea la un antigen sau a altor tipuri de stimulare. Granzymes exprimate CD8 + o majoritate și minoritate de celule T CD4 + sensibilizate in vitro cu antigenul sau lectina [8]. gena granzimă M este exprimat numai în celulele NK, în timp ce alte subfamilia granzymes, codificat de locus Met-azei sunt mult mai răspândite.
Granzymes sunt supuse DPPI finale de prelucrare atunci când ambalate în granule citotoxice și stocate ca enzime active, gata pentru administrare la contactul cu celula țintă. Granulele au două zone vizibile sub cercetarea ultrastructurală. Fiecare are un miez central dens care conține granzymes, granule perforin toxina și acid condroitin sulfat proteoglican (CS). sarcină negativă net facilitează conectarea la granzymes CS, care sunt de bază și încărcat pozitiv la granule de pH. Zona exterioară a fiecărei granule are o structură mai tipică pentru lizozomul obișnuit. Granulele sunt distribuite aleator în citoplasmă, dar ele sunt mutate rapid la locul de contact cu o celulă țintă în contact atunci când se realizează conexiunea, într-un proces cunoscut sub numele de polarizare.
Funcția apototică a granzimului B
Principala funcție a granzimelor este inducerea morții virusurilor infectate și a altor celule potențial periculoase. Ei realizează acest lucru prin utilizarea substraturilor-cheie în celulele țintă printr-o cale dependentă de perforină. șoarecii perforin deficienți au eșec absolut toate căile morții celulare mediate de granzimă și inducerea și sensibile la o varietate de virusuri și alți agenți patogeni intracelulare, cum ar fi Listeria monocytogenes [9]. Granzimă B are cea mai mare activitate apoptotică a tuturor granzymes datorită capacității sale de a cliva substraturi caspazelor prin resturile cheie de acid aspartic. Cu toate acestea, șoarecii cu deficit de granzimă B au un deficit mult mai blând imun decât șoarece perforinei defetsitnye; Se presupune că există o redundanță funcțională în apoptoza indusă de granzimă. In vitro, CTLs granzima B-soareci cu deficit stimula fragmentarea ADN-ului în celulele țintă mult mai lent decât CTLs șoarecii de tip sălbatic [10]. Alte granzymes sunt activitate considerabil mai slabe apoptotice, granzima ilustrat cel mai bine A, triptaza, care poate intensifica moartea celulelor granzimă B-mediată. Granzima A poate stimula activarea caspazei este mult mai puțin eficientă decât granzima B, dar are un efect apoptotic diferit datorită capacității sale de a scinda substraturi de caspaze.
Capacitatea granzymei B de a induce moartea celulară a fost recent studiată în detaliu. Granzimă B se poate scinda și astfel activați mai multe procaspases direct, de asemenea, poate fi de a descompune unele substraturi caspazei, incluzând un inhibitor al activării caspazei DNase (ICAD). Acest lucru poate afecta în principal fragmentarea ADN-ului în celula țintă. Supraexpresia proteinei anti-apoptotice Bcl-2 in mitocondrie inhibat complet granzimă B, ceea ce indică faptul că distrugerea mitocondriilor este o moarte celulară parte necesară mediată de granzimă [11]. Recent, am arătat că în celulele umane și murine familiei proapoptotic membru al Bcl-2 Bid rapid scindată în mod specific de către granzima B Acid distally aspartic la poziția 75, iar molecula scurtat Bid inserată în membrana mitocondrială pentru a induce eliberarea de mediatori proapoptotici, inclusiv citocrom c și Smac / Diablo [12]. Pe lângă mecanismele dependente de caspază sunt disponibile și caspazei independent cai: celulele în care persistă activitatea caspazei, totuși distrus granzymes. Cu toate că mecanismele de caspazei independente nu sunt bine înțelese, dar este probabil ca acestea sunt puse în aplicare prin distrugerea citoscheletului.
Funcțiile non-apototice ale granitului
Granzymes au descoperit o serie de funcții suplimentare, în special asemănătoare tripsinei granzimă A, care pot fi implicate în reglarea proliferării limfocitelor B. Purificate de șoarece granzimă A poate avea un efect mitogen asupra celulelor B în absența antigenului, și mai asemănătoare cu alte „triptază“, cum ar fi trombina și tripsină. Granzimă O poate scinda un număr de proteine ale matricei extracelulare și prin aceasta facilitează migrarea celulelor T și NK în țesuturi. Granzima B poate induce, de asemenea, secreția de citokine care activează în mod direct anumite citokine și, astfel, să consolideze unele tipuri de inflamație. Granzimă O poate scinda receptorul trombina după secvența Leu-Asp-Pro-Arg pentru a induce eliberarea de interleukine IL-6 și IL-8 din monocite și retragerea neurite în oligodendrocite. Rolul granzymes A și B în controlul direct al infecției virale a fost gasit la soareci, cu perturbarea vizate de gene granzymes A și B, având ca rezultat soareci au aratat pronuntat sensibilitate la infecția cu un virus Orthopox citopatic, ectromelia. In ciuda acestui fapt, granzima-soareci cu deficit A sunt capabile să răspundă în mod normal la noncitopatic virusul coriomeningitei limfocitare (LCMV), și un agent patogen bacterian intracelular Listeria monocytogenes, și poate elimina o parte din tumoare singenică la o rată tipică de animale convenționale.
Substanța specifică și inhibitorii de granzimă
Granzima B au o specificitate foarte mare de substrat, în concordanță cu rolul lor mai mult decât enzimele de prelucrare distructive. proteazele digestive, cum ar fi tripsina, chimotripsina și elastaza, au o gamă foarte largă de substraturi și amino reziduuri de substrat mediu P1 acidul nu este la fel de importantă ca și cea a granzymes, în care mai mult de 5 resturile adiacente poziției P1 poate afecta recunoașterea și clivaj. Specificitatea de substrat complet definit pentru granzymes A și D și triptază 2 (toate sunt triptazei și ele sunt adesea caracterizate prin capacitatea lor de a scinda Na-CBZ-L-lizină tiobenzilovy eter) pentru granzima B ( „Asp-ază“, clivaj la aspartic acidul și, eventual, de acid glutamic), granzima M (de asemenea, cunoscut sub numele de "Met-ază" și scindarea metioninei) și granzimă H (chymase). Granzimă B este o serin protează, care este caracteristic numai pentru mamifere, care acționează asupra lanțului lateral al acidului [14], este necesar să se efectueze funcția proapoptotic de clivaj al enzimei ofertei și procaspase.
compuși sintetici diverse, incluzând eter peptid-tiobenzilovy, 7-amino-4-metilcumarină și derivații paranitroanilida (pNA) au fost studiate pentru a determina substrat și clivaj optime condiții pentru granzymes. Cele mai bune substraturi paranitroanilidnymi sunt D-Pro-Phe-Arg-pNA pentru granzima murine A și tosil-Gly-Pro-Arg-pNA pentru granzima O persoană. Ambele Granzima A inactivat de inhibitori ai serin proteazelor, cum ar fi diizopropilflyuorofosfat, fenilmetilsulfonilflyuorid, bezamidin, aprotinină, leupeptină și inhibitor de tripsină de soia. Mai mult, ambele tipuri de granzymes A poate fi blocat de un număr de inhibitori fiziologice, cum ar fi a2-macroglobulina, antitrombina III și C1-inhibitor esteraza, care poate proteja țesutul înconjurător împotriva daunelor cauzate de degranulare adverse [15]. Mulți inhibitori ai granzimei A inhibă granzima B doar ușor. Intr-un studiu de mare a dovedit cel mai bun inhibitor al inhibitorului uman? 1 proteazei, care determină o reducere a activității granzimei B cu 85% atunci când este utilizat la o doză de 10 mg / ml [14].
În ciuda semnificației lor biologice, granmiile sunt încă destul de prost înțelese și multe întrebări importante așteaptă răspunsul lor. Natura sinergiei dintre perforin și granzimă - mecanismul prin care granmiile ajung de la endozomi la celule țintă nu este încă suficient de clar. cai caspazei independent de celule moarte sunt importante, deoarece acestea permit CTLs pentru a distruge celulele care au fost blocate inhibitori ai caspazelor virale, cum ar fi modificator al răspunsului citokinelor A (crmA), poxvirides sintetizați. Din nou, natura acestor căi nu a fost încă explicată. Granzima B, dar A și B, desigur, au, de asemenea, o mulțime de caracteristici care nu sunt asociate cu apoptoza, si studiul de soareci cu deficit intr-o anumita gena granzymes ar trebui să facă lumină în acest domeniu de cercetare. Este interesant să aflați mai multe despre reglementarea funcțiilor de granit cu ajutorul unor noi serpini. Aceste studii pot fi foarte importante pentru ideile noastre cu privire la homeostazia imunitar (de exemplu, reglementarea CTL ca răspuns la infecții), și ca răspuns la infecții virale și cancer.