Izolarea culturi pure de bacterii fitopatogene dintr-o singură celulă este foarte importantă în studiul formării coloniei, procesele de reproducere, variabilitatea și efectul eredității asupra bacteriilor patogene ale plantelor de diferite dezinfectante, antibiotice etc. Multe metode de izolare a celulelor unice propuse în literatura de specialitate. Aici vom descrie doar câteva dintre ele.
Metoda fracțională a lui Pasteur
Această metodă este folosită în prezent foarte rar și are o mare semnificație istorică. Se compune din următoarele.
O cantitate mică de material introdus într-un număr de flacoane cu bulion steril sau alt mediu nutritiv lichid, în așa fel încât, în ultimul tub a ramas aproximativ o celula la care se obține reproducerea unei culturi pure. Acest lucru se face astfel: o picătură de material de testare, care conține aproximativ 1 000 000 de celule bacteriene, este introdusă într-un tub cu 10 ml mediu și amestecat bine. Apoi, din acest tub 1 ml este transferat în altul (de asemenea în 10 ml de mediu) și din nou bine agitat. Această procedură este repetată în mod consecvent de cinci până la șase ori mai mult. În ultima eprubetă, se obține o celulă bacteriană, din care se dezvoltă o cultură curată.
Metoda de diluare urmată de însămânțarea pe un mediu nutritiv solid
Din 1 ml dintr-o suspensie de bacterii care conține 30.000.000 de corpuri microbiene (conform metodei fotometrice), cu respectarea regulilor de sterilitate, sunt efectuate diluții de 10 ori până la 10-8.
Astfel, în penultima eprubetă (diluție 10b-7) ar trebui să existe aproximativ trei celule microbiene. Apoi, se transferă 1 ml din fiecare dintre ultimele trei diluții și se distribuie uniform cu o spatulă pe plăcile uscate Petri cu agar de cartof sau cu alt mediu nutritiv solid. Plăcile sunt plasate într-un termostat timp de 24 de ore, apoi depozitate la temperatura camerei. În cea de-a treia zi, în cupă se dezvoltă singure colonii. Folosind această tehnică, se poate presupune că fiecare colonie a crescut de la o celulă.
În plus față de cernerea de suprafață a materialului sursă diluat, se utilizează metoda de cernere în profunzimea unui mediu nutritiv dens în conformitate cu R. Koch. Metoda are dezavantaje semnificative - coloniile din interiorul mediului cresc încet, caracteristicile lor morfologice nu sunt caracteristice, extracția unor astfel de colonii este dificilă. Prin urmare, este necesar să se aplice metode care să creeze condiții pentru izolarea unei culturi pure de la o celulă bacteriană cunoscută. Acest lucru se face sub controlul unui microscop care utilizează dispozitive pentru micromanipulare.
Metoda microcoloniilor
În comparație cu metoda de cernere a suspensiei bacteriene, metoda micro coloniilor are avantajul că, atunci când se aplică, se face izolarea directă a culturii de la o celulă.
Esența metodei este aceea că se prepară o suspensie foarte diluată în 0,5% agar sau gelatină din celulele microbiene de diluat, care se aplică subțire pe suprafața sticlei sterile. Sticla este fixată deasupra unei camere umede, sub forma unei culise cu caneluri sau un inel de sticlă.
Preparatul cu celule individuale sub controlul microscopului este plasat într-un termostat până când se formează coloniile. Apoi, folosind o buclă sau o pipetă, coloniile sunt transferate în tuburi de testare separate.
Metoda microcoloniilor face posibilă folosirea unor mari măriri ale microscopului și protejarea relativ fiabilă a microcoloniilor de uscare și contaminare din exterior.
Din punct de vedere tehnic, metoda este accesibilă și fiabilă, deoarece coloniile care au crescut de la celule individuale sunt transferate în mediile nutritive și este exclusă transferul rudimentar și nesigură de mâna unor celule mici individuale.
Metoda blocului de agar Erskov
Suspensia microbiană este aplicată pe strat Agapa 2- 3 mm grosime, plasate pe un pahar steril și apoi se separă pătrate de agar sunt transferate pe sticlă steril coverslip-barata, care este închisă de la suprafață cu o lamelă de acoperire sterilă. Sub microscop, folosind un sistem uscat sau de imersiune și un iluminat mat, marcați acele pătrate de agar care conțin o celulă. Ochelarii sunt plasați într-un termostat. Piesele de agar, împreună cu coloniile cultivate în ele, sunt transferate pe un mediu nutritiv cu ajutorul unui ac de platină.
Principalul dezavantaj al metodei este posibilitatea contaminării din aerul ambiental.
Metoda Hort cu plăci perforate
Un strat subțire de agar este turnat pe suprafața sterilă a culisei, după care, după întărire, se aplică o suspensie bacteriană puternic diluată. Pe agar se aplică o placă perforată celuloidă subțire, iar partea de sus este acoperită cu o alunecare sterilă. Sub microscop, celulele care conțin o celulă sunt marcate. Coloniile cultivate în astfel de celule sunt transferate prin "harpon" în mediul nutritiv.
Metoda scutului de mercur al lui Fuel, Bernard și Wilson
Această metodă constă în următoarele: o cantitate mică dintr-o cultură de șase ore a bacteriei studiate este introdusă în gelatină 10% pe apă peptonă și menținută la 37 ° C timp de 2 ore. O picătură mică de gelatină este loopată pe un tobogan steril și acoperită cu o sticlă de acoperire sterilă din cuarț sau selinit. Lichidul trebuie distribuit într-un strat subțire și complet lipsit de bule de aer. O singură celulă se găsește sub microscop. Un cuart de mercur se aplică pe sticla cuarțului deasupra cuștii cu un fir subțire de fier. Preparatul este apoi iradiat cu lumină ultravioletă dintr-o lampă de cuarț (timp de 1 minut la o distanță de 7,5 cm de lampă). Ca urmare, toate bacteriile, cu excepția celor protejate cu mercur, mor. O zi mai târziu, din celula supraviețuitoare, se dezvoltă o colonie, care este transferată într-un mediu lichid.