Capacitatea celulelor de a-și menține ordinea înaltă a organizației depinde de informațiile genetice, care sunt stocate sub formă de acid deoxiribonucleic (ADN). ADN-ul este o substanță din care sunt compuse genele. Reproducerea organismelor vii, transferul proprietăților ereditare de la o generație la alta și dezvoltarea unui organism multiceluros dintr-un ovul fertilizat sunt posibile, deoarece ADN-ul este capabil de auto-reproducere. Însuși procesul de auto-reproducere a ADN-ului se numește replicare. Uneori se folosește și numele-sinonim - reduplicarea.
Matricea sintezei ADN
În plus, sinteza ADN-ului este caracterizată de proprietăți precum antiparalelismul și unipolaritatea. Fiecare șir de ADN are o anumită orientare. Un capăt poartă gruparea hidroxil (OH) atașată la carbonul 3 'în deoxiriboză de zahăr, la celălalt capăt al lanțului este restul acidului fosforic la poziția 5' a zahărului. Două fire complementare din molecula ADN sunt orientate în direcții opuse - antiparalerale (pentru o orientare paralelă, capătul 3 'al unui lanț ar fi capătul 3' al celeilalte). Enzimele care sintetizează noi fire de ADN, numite ADN polimeraze, se pot deplasa de-a lungul lanțurilor de matrice într-o singură direcție - de la capetele lor 3 'la capetele 5'. În acest caz, sinteza toroanelor complementare se efectuează întotdeauna în direcția 5 '3', adică unipolară. Prin urmare, în procesul de replicare, sinteza simultană a lanțurilor noi devine antiparallelă.
ADN-polimerazele pot da o "inversă", adică se deplasează în direcția 3 '5'. În cazul în care ultima unitate de nucleotide adăugată în timpul sintezei sa dovedit a fi o nucleotidă necomplementară a lanțului de șablon, aceasta va fi înlocuită cu o nucleotidă complementară. Prin desprinderea nucleotidei "greșite", ADN-polimeraza continuă să sintetizeze în direcția 5 '3'. Această abilitate de a corecta erorile a fost numită funcția corectoare a enzimei (vezi mai jos).
În 1957, A. Kornberg a descoperit o enzimă în E. coli, care catalizează procesul de polimerizare a ADN-ului de la nucleotide; a fost denumită ADN polimerază. Apoi, ADN polimeraza a fost detectată în alte organisme. Sa demonstrat că substraturile tuturor acestor enzime sunt trifosfații deoxiribonucleozidici (dNTP) polimerizați pe un șablon de ADN monocatenar. ADN polimeraza construiește în mod consecvent un lanț de ADN monocatenar, pas cu pas, adăugând la el următoarele legături în direcția de la capătul 5 'la capătul 3', unde alegerea următorului dNTP este dictată de matrice. Montarea fiecare nou resturi de nucleotide la capătul 3 'al lanțului de creștere este însoțită de hidroliza unei legături bogate în energie între resturile prima și a doua fosfat în scindarea dNTP și pirofosfatul, ceea ce face ca reacția generală este avantajoasă energetic.
În celule, există de obicei mai multe tipuri de polimeraze ADN care au diferite funcții și au structuri diferite: ele pot fi construite dintr-un număr diferit de lanțuri de proteine (subunități), de la unul la zeci. Cu toate acestea, toți lucrează pe orice secvență de nucleotide a matricei; Sarcina acestor enzime este de a face o copie exactă a fiecărei matrice.
Acuratețea sintezei ADN și mecanismul corecției
Materialul genetic al organismelor vii este imens și se repetă cu o mare acuratețe. În medie, nu apar mai mult de trei erori în timpul reproducerii genomului de mamifere, constând din ADN cu o lungime de 3 miliarde de perechi de nucleotide. În acest caz, ADN-ul este sintetizat extrem de rapid (viteza sa de polimerizare variază de la 500 nucleotide / sec în bacterii la 50 nucleotide / s la mamifere). Precizia ridicată a replicării, împreună cu viteza ridicată, este asigurată de prezența unor mecanisme speciale care efectuează corectarea, adică eliminarea erorilor. Esența mecanismului de corecție este că ADN polimerază, dublu-verificare matrice de potrivire fiecare nucleotidă: o dată înainte de a fi încorporat în lanțul de creștere și a doua oară înainte de următoarea nucleotidă este inclusă. O altă legătură fosfodiester este sintetizat numai în cazul în care ultimul (3'-terminal) lanțului de creștere nucleotidice de ADN format adecvat pereche Watson-Crick cu matricea nucleotidică corespunzătoare. Dacă, în stadiul anterior al reacției, s-a produs o pereche eronată de baze, atunci polimerizarea ulterioară se oprește până când eroarea este corectată. Pentru a face acest lucru, enzima se deplasează în direcția opusă și taie ultima legătură adăugată, după care locul ei poate lua precursorul nucleotidului corect. Cu alte cuvinte, multe (dar nu toate) polimerazele ADN au, în plus față de activitatea sintetică 5'-3“, și totuși activitatea 3'-hidrolizare, care îndepărtează nucleotidele nepotrivite din matricea.
Principiile de bază ale replicării
Regulile de bază, conform cărora are loc replicarea, au fost elucidate în experimentele cu bacterii, dar sunt valabile și pentru organismele mai înalte.
Inițierea lanțurilor ADN
ADN-polimerazele nu pot începe sinteza ADN-ului pe matrice, ci pot adăuga noi unități de dezoxiribonucleotide la capătul 3 'al unui lanț polinucleotidic deja existent. Un astfel de lanț preformat, la care se adaugă nucleotide, se numește primare. Un primer ARN scurt sintetizează din trifosfații de ribonucleozidă enzimatică o enzimă care nu are activitate corectivă și se numește primar ADN (de la primerul-grund englez). Activitatea primazică poate să aparțin fie unei singure enzime, fie unei subunități ADN polimerazice. Primerul sintetizat de această enzimă inexactă, incapabil să corecteze erorile, diferă de restul benzii de ADN nou sintetizat, deoarece constă din ribonucleotide și poate fi îndepărtat în continuare.
Dimensiunea primerului ribonucleotidic este mică (mai mică de 20 de nucleotide) în comparație cu dimensiunea lanțului ADN format de ADN polimeraza. Îndeplini funcția de primer ARN este îndepărtată printr-o enzimă specifică, iar diferența rezultată este sigilat cu polimerază ADN, folosind ca primer capăt 3'-OH a unui fragment Okazaki adiacent (vezi mai jos). Removal primeri ARN extreme complementare la capetele 3“ale ambelor catene ale moleculelor de ADN părinte liniar conduce la faptul că lanțurile de copii sunt mai scurte de 10-20 nucleotide (in diferite specii de primeri ARN de diferite dimensiuni). Aceasta este așa numita "problemă de subreplicare a capetelor moleculelor liniare". În cazul bacterian inelar replicarea ADN-ului această problemă nu există, ca și prima dată a formării de primer ARN este îndepărtată de enzima, care umple și golul format prin creșterea capătul 3'-OH a lanțului de ADN în creștere, care vizează „coada“ este îndepărtată primer. Problema subreplicării capetelor 3 'ale moleculelor de ADN liniar este rezolvată prin celule eucariote folosind o enzimă specială numită telomerază.
In 1985, el a fost găsit în ciliate ravnoresnichnoy Tetrahymena thermophila, iar mai târziu - în drojdii, plante și animale, inclusiv ovarele și imortalizată (nemuritoare) linii de celule umane, cancer HeLa. Telomeraza este o ADN polimerază care completează capetele 3 'ale moleculelor ADN cromozomiale liniare cu secvențe scurte (6-8 nucleotide) repetate (la vertebrate, TTAGGG). Conform nomenclaturii, această enzimă se numește ADN-nucleotidă-exotransferază sau transferază terminală telomerică. În plus față de partea proteică, telomeraza conține ARN, care acționează ca un șablon pentru replicarea ADN. Lungimea ARN-ului telomerazei variază de la 150 nucleotide în protozoare până la 1400 nucleotide în drojdie, la om - 450 nucleotide. Simplul fapt de a avea în moleculă o secvență de ARN la care sinteza ADN este o bucată de matrice poate fi atribuită telomerazei deosebit revers transcriptaza, o enzimă care este capabilă să conducă sinteza ADN-ului pe șablon ARN.
Datorită faptului că, după replicarea ADN fiecare copil al lanț părinte sunt mai scurte ca dimensiune a primilor primeri ARN (10-20 nucleotide), sunt formate proeminente irecuperabile 3 „unice ale lanțului părinte. De asemenea, au recunoscut de telomeraza, care crește secvențial lanțul părinte (de sute umane ori) folosind 3'-OH capetele lor ca primeri și ARN care este o parte a enzimei, ca matriță. Formatele capete lungi monocatenare, la rândul lor, servesc drept matrice pentru sinteza lanțurilor fiice prin mecanismul tradițional de replicare.
Reducerea treptată a ADN-ului cromozom în timpul replicării este una dintre teoriile "îmbătrânirii" coloniilor celulare. În 1971, omul de știință rus A.M. Olovnikov marginotomii în teoria sa (din latină marginalis -kraevoy, vol. - Secțiunea) a sugerat că acest fenomen este baza potențialului limitat de dublare observată în celulele somatice normale de creștere în cultură in vitro, așa-numita „limita Hayflick“. om de știință american Leonard Hayflick la începutul anilor '60 au arătat că în cazul în care cultura ia celulele nou-născuților, atunci ei pot merge 80-90 diviziune, în timp ce celulele somatice ale tinerilor in varsta de 70 de ani sunt împărțite în doar 20 până la 30 de ori. Restricția privind numărul de diviziuni celulare se numește limita Hayflick.
Răsucirea ADN-ului dublu de helix
Deoarece sinteza ADN are loc pe un șablon monocatenar, trebuie precedată de separarea obligatorie (cel puțin în timp) a celor două fire ADN. Studiile efectuate la începutul anilor '60 la cromozomi de replicare a relevat un domeniu specific, bine definit de replicare, se deplasează de-a lungul părinte helix ADN-ului și având o divergență locală a două dintre lanțurile. Din cauza formei sale Y, această regiune activă a fost numită furculiță de replicare. În ea, ADN-polimerazele sintetizează moleculele ADN-ului fiică. Cu ajutorul microscopiei electronice a replicării ADN, a fost posibil să se stabilească faptul că o zonă care este deja replicată are forma unui ochi în interiorul ADN-ului nereplicat. Este important de observat că ochiul de replicare se formează numai în acele locuri ale moleculei în care există secvențe specifice de nucleotide. Aceste secvențe, numite originea replicării, constau în aproximativ 300 de nucleotide. În funcție de existența unei replicări în una sau două direcții (și depinde de natura organismului), ochiul conține una sau două furci de replicare. Mișcarea succesivă a furculiței de replicare duce la o extindere a oțelului.
ADN-ul dublu helix este foarte stabil; pentru ca acesta să se deschidă, aveți nevoie de proteine speciale. Enzimele speciale ale helicazei ADN se mișcă rapid de-a lungul unei singure fire de ADN folosind energia de hidroliză ATP pentru transport. Întâlnindu-se pe drumul unui șantier dublu, le rupe legăturile hidrogen între baze, separă lanțurile și avansează furculița de replicare. După aceasta, proteinele speciale de destabilizare a spiralei sunt asociate cu fire simple de ADN, care nu permit închiderea unei singure fire de ADN. În același timp, ele nu acoperă bazele ADN-ului, lăsându-le disponibile pentru împerechere.
Nu trebuie să uităm că firele complementare ale ADN-ului sunt răsucite unul după celălalt într-o spirală. Prin urmare, pentru ca furculița de replicare să avanseze, întreaga parte necorespunzătoare a ADN-ului ar trebui să se rotească foarte rapid. Această problemă topologică este rezolvată prin formarea în spirală a unui fel de "balamale" care permit lanțurilor ADN să se relaxeze. Aparținând unei anumite clase de proteine numite ADN-topoizomeraza sunt introduse într-un singur fir de ADN dublu-pauze Strand, permițând catenele ADN se separe și apoi sigilat aceste discontinuități. Topoizomerazele sunt, de asemenea, implicate în dezangajarea inelelor intercalate cu dublu catenar formate în timpul replicării ADN-ului dublu catenar inelar. Cu ajutorul acestor enzime importante, dublul helix al ADN-ului din celulă poate lua o formă "sub-răsucite" cu mai puține rotații; într-un astfel de ADN, separarea celor două lanțuri ADN în furculița de replicare este mai ușoară.
Sinteza ADN intermitentă
Este ușor să ne imaginăm că replicarea are loc prin creșterea continuă a nucleotidei din spatele nucleotidei ambelor lanțuri noi, pe măsură ce forța de replicare se mișcă; În acest caz, din moment ce cele două fire în helixul ADN sunt antiparalerale, una dintre lanțurile fiice ar trebui să crească în direcția 5'-3 ', iar cealaltă în direcția 3'-5'. De fapt, sa dovedit că lanțurile fiicei cresc numai în direcția 5'-3 ', adică, capătul 3' al seminței întărește întotdeauna și matricea este citită de ADN polimeraza în direcția 3'-5 '. Această afirmație, la prima vedere, pare incompatibilă cu mișcarea furcii de replicare într-o singură direcție, însoțită de citirea simultană a două fire antiparalene. Soluția secretului constă în faptul că sinteza ADN are loc continuu numai pe unul dintre circuitele de matrice. În a doua catenă matriță de ADN este sintetizat fragmente relativ scurte (100do lungime de 1000 de nucleotide, în funcție de specie), numit pentru omul de știință care le-au descoperit fragmente Okazaki). Lanțul nou format, care este sintetizat în mod continuu, este numit cel care conduce, iar celălalt, colectat din fragmente de Okaucas, rămase în urmă. Sinteza fiecăruia dintre aceste fragmente începe cu un primer ARN. După ceva timp primer ARN este îndepărtat, golurile sunt construite ADN polimerază și fragmentele sunt capsate în enzimă specifică o catenă de ADN continuu.
Acțiunea cooperativă a proteinelor din furculița de replicare.
Până acum, am vorbit despre participarea proteinelor individuale în replicare ca și cum ar fi lucrat independent una de cealaltă. Între timp, în realitate, majoritatea acestor proteine sunt combinate într-un complex mare care se deplasează rapid de-a lungul ADN-ului și pune în aplicare în mod consecvent procesul de replicare cu o precizie ridicată. Acest complex este comparat cu o mică "mașină de cusut". "detalii" sunt proteine individuale, iar sursa de energie este reacția de hidroliză a venelor nucleozidice trifosfatice. Helixul este nelegat de helicază ADN; Acest proces este asistat de topoizomeraza ADN-ului, care dezvăluie firele ADN și o multitudine de molecule de proteine destabilizante care se leagă la ambele catene ADN unice. În regiunea furculiței, două polimeraze ADN acționează asupra lanțului principal și întârziat. Pe lanțul de conducere, ADN-polimeraza funcționează continuu, iar enzima îndelungată întrerupe și își reia activitatea utilizând primeri de ARN scurți sintetizați de primaza ADN. Moleculele de primază ADN sunt direct legate de helicază ADN, formând o structură numită primimozom. Primosomul se mișcă în direcția deschiderii furcii de replicare și sintetizează primerul ARN pe parcursul mișcării fragmentelor lui Okazaki. ADN polimeraza din lanțul de conducere se mișcă în aceeași direcție și, deși este dificil de imaginat la prima vedere, ADN polimeraza din lanțul întârziat. Pentru a face acest lucru, se crede că acesta din urmă impune un lanț de ADN, care servește ca o matrice pentru sine, ceea ce asigură inversarea ADN polimerazei lanțului de întârziere cu 180 de grade. Mișcarea coordonată a celor două polimeraze ADN asigură replicarea coordonată a ambelor toroane. Astfel, aproximativ douăzeci de proteine diferite (dintre care am numit doar o parte) lucrează simultan în furculița de replicare, realizând un proces complex, foarte ordonat și consumator de energie.
Consecvența proceselor de replicare ADN și de divizare a coagulării
Celulele eucariote trebuie să sintetizeze copii ale tuturor cromozomilor înainte de fiecare divizare. Replicarea ADN a cromozomului eucariot este realizată prin împărțirea cromozomului într-un număr de repliconi separați. Astfel de repliconi nu activează toate în același timp, dar diviziunea celulară trebuie să fie precedată de replicarea unică obligatorie a fiecăruia. Din cele de mai sus rezultă că, pe cromozomul eucariotelor, o multitudine de furci de replicare se pot mișca independent în orice moment. Oprirea mișcării furcii are loc doar atunci când se ciocnește cu o altă furcă care se mișcă în direcția opusă sau când ajunge la capătul cromozomului. Ca rezultat, întregul ADN cromozom este reprodus într-un timp scurt. După asamblarea proteinelor cromozomiale pe o moleculă de ADN, fiecare pereche de cromozomi în procesul de mitoză este ordonată în ordine în celulele fiice.
Procesul de replicare a ADN-ului este în concordanță cu diviziunea celulară și necesită acțiunea în comun a multor proteine. Aceasta implică:
1. proteine ADN-chelicază și proteine destabilizatoare; ei dezvăluie dublul helix al ADN-ului parental și formează o furculiță de replicare.
2. ADN polimeraze care catalizează sinteza lanțului de polinucleotidă ADN în direcția 3'-5 prin copierea matricei într-o furcă de replicare cu un grad ridicat de precizie. Deoarece cele două fire ale dublului helix de ADN sunt antiparalerale, numai unul dintre cele două lanțuri este sintetizat continuu în direcția 5'-3 ', ceea ce duce; un alt lanț, întârziat, este sintetizat sub formă de fragmente scurte de Okaucasia. ADN-polimeraza este capabilă să-și corecteze propriile erori, însă nu poate începe independent sinteza unui lanț nou.
3. primaza ADN, care catalizează moleculele de primer primar de ARN. Ulterior, fragmentele de ARN sunt eliminate - sunt înlocuite cu ADN.
4.Telomeraza, care completează construcția de 3'-capete ale moleculelor ADN lineare subreplicate.
5. Topoizomeraze ADN care ajută la rezolvarea problemelor de torsiune și entanglementare a helixului ADN.
6. Proteine inițiatoare care se leagă la originea replicării și contribuie la formarea unui nou ochi de replicare cu una sau două furci. În fiecare furculiță, urmând proteinele inițiatorului la ADN-ul încâlcit, este unite mai întâi un complex proteic format din ADN-helicază și primaza ADN (primoxoma).
Apoi alte proteine sunt adăugate la primosom și apare o "mașină de replicare" care efectuează sinteza ADN-ului.