Microscopie cu crisoele electronice: cum să vezi mai mult
Conducători experți mondiali și-au împărtășit experiența cu tinerii cercetători din Sankt-Petersburg în domeniul uneia dintre cele mai avansate tehnologii din biologia celulară și moleculară.
Vorbind despre diferite descoperiri și studii, adesea am trecut cu vederea metodele și dispozitivele cu care oamenii de știință obțin rezultate. Instrumentele științei din secolul 21 pot fi un conducător convențional, o lupă sau un calculator. Dar nimic nu stă încă, și acum, cu ajutorul unor dispozitive de ultimă oră, puteți vedea atomii individuali și adâncimile spațiului, care sunt la distanță de la noi milioane de kilometri. Este adevărat că este mult mai dificil să folosiți astfel de dispozitive decât o riglă și o lupă.
Secțiunea transversală a capului de Caenorhabditis elegans obținută folosind metoda de criofixare. Acest nematod care trăiește liber, de aproximativ 1 mm lungime, a devenit de mult obiect model preferat - primul organism multicelulare al cărui genom este complet descifrat
Fuziunea unui fagozom care conține Mycobacterium tuberculosis (un agent cauzator al tuberculozei) cu un lizozom. Deci, micobacteriile înșală sistemul imunitar. (Nicole van der Wel și Peter J. Peters, Institutul Cancer de Olanda, Amsterdam.)
Un om de știință adevărat învață ceva tot timpul. Recent, Centrul de Resurse pentru Dezvoltarea Tehnologiilor Moleculare și Celulare de la Universitatea de Stat din St. Petersburg a găzduit Școala "Metode de microscopie crioelectronică și pregătire de probe". Elevii și cercetătorii, sub îndrumarea experților de vârf ai lumii în domeniul pregătirii probelor, au învățat să lucreze la cele mai sofisticate dispozitive. Desigur, în câteva zile este imposibil să stăpânești toate tehnicile, dar să înțelegi cum funcționează și ce studii pot fi realizate prin metodele prezentate, este.
membranară de transport, pentru care cercetarea a acordat Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină în acest an Shekmanu Randy, James Rothman și Thomas Zyudofu, astăzi este, de asemenea, investigat utilizând metodele în cauză.
Avantajul Tokuyasu, numit după omul de știință care a dezvoltat - Kioteru Tokuyasu (Kiyoteru Tokuyasu), cea a țesutului după tratament și fabricarea cele mai subțiri felii își păstrează imunogenitatea sa, și anume capacitatea unui antigen străin cauza răspunsului imun al organismului. Interesul cercetătorilor biomolecule pot fi etichetate cu anticorpi la nanoparticule de aur, și apoi la microscop pentru a vedea distribuția moleculelor etichetate.
Atunci când se lucrează la un astfel de nivel micro, modul în care structura internă a celulelor, este important să nu se deterioreze obiectul să-și păstreze structura sa inițială. "Metodele clasice de microscopie electronică necesită utilizarea de substanțe speciale, agenți de fixare, care protejează legăturile transversale. Acest lucru asigură o bună conservare a probei, cu toate acestea, un astfel de tratament duce la o serie de artefacte, cum ar fi pierderea spațiilor intercelulare. În acest sens, popularitatea fixării cu ajutorul înghețării obiectului este în creștere. În condiții normale de îngheț, apa formează cristale de gheață care dăunează mostrei. Există mai multe abordări pentru a evita cristalizarea. Prima abordare - utilizarea de substanțe care previn congelare la temperaturi scăzute, de exemplu, zaharoză, ca în metoda Tokuyasu. A doua abordare este utilizarea unor condiții speciale: răcirea instantanee și creșterea presiunii. În acest caz, eșantionul poate fi înghețate într-o așa-numită „vitrificate“ de stat în gheață amorf atunci când rețeaua de cristal de gheață nu are timp pentru a forma și de model pentru toate procesele au loc în ea se înregistrează simultan. În condiții criogenice, este posibil să se facă secțiuni din eșantionul rezultat, este posibilă înlocuirea apei cu un solvent organic. În acest caz, atât structura probei cât și imunogenitatea acesteia sunt reținute cât mai mult posibil.
Dacă este necesar să se examineze complexele proteine individuale, fagi, virusuri, bacterii si chiar mici, pot fi înghețate în întregime pe o manta specială, fără a fi nevoie să secționare. Acest lucru poate fi important, de exemplu, în determinarea mecanismului de penetrare a virusului în celulă și conformația proteinei de suprafață în funcție de factori cum ar fi pH-ul. » - I-am explicat unele dintre subtilitățile microscopie crio-electroni, director al Centrului de Resurse doctorat Paul Zykin.
Unul dintre profesorii de la Școala a devenit Galina Beznusenko, un membru al Institutului European de Oncologie din Milano. "Cut-urile de criosuri fac posibilă la nivel ultrastructural producerea etichetelor duble și triple. Asta este de a caracteriza poziția proteinei într-o celulă poate fi marca simultan și proteina în sine, și acele compartimente între care se mișcă, cum ar fi reticulul endoplasmatic și aparatul Golgi. La temperatura camerei, este dificil să se facă, din cauza nevoii de fixare chimică puternică a materialului, ceea ce reduce probabilitatea de detectare a acestor proteine specifice de anticorp. Acum, astfel de studii sunt foarte populare, după cum reiese din decernarea Premiului Nobel pentru Fiziologie sau Medicină din acest an este doar în jurul studiul transportului intracelular. Înțelegerea mecanismelor de transport intracelulare necesare pentru studiul oricărui proces care apar in organism, care prezintă exact cum să aplice aceste sau alte medicamente, și de ce există boli legate de metabolism, - a spus Galina de ce metode kriomikroskopicheskie sunt importante pentru medici si biologi - de exemplu, există o boală atât de gravă - fibroza chistică. Ca rezultat al proteinei mutatie implicate in transportul ionilor de clor prin membrana celulară, nu lasă reticulului endoplasmatic, ceea ce duce în final la ruperea unui număr de organe. Există și alte boli care se bazează pe o încălcare a transportului intracelular. Prin urmare, este atât de important să stăpânești cele mai avansate metode care vă permit să studiați toate aceste procese ".
Echiparea centrului de resurse Galina Beznusenko a apreciat foarte mult. Dar a remarcat o serie de deficiențe - plasarea foarte strânsă a echipamentului, lipsa suprafețelor de lucru pentru lucrările pregătitoare. Când lucrați cu astfel de materiale subțiri în toate sensurile, microclimatul, circulația aerului, disponibilitatea meselor libere pentru lucru sunt extrem de importante. Dacă fluxurile de aer nu sunt îndreptate așa cum ar trebui, atunci este foarte dificil să obțineți o reducere bună.
Helmut Gnaegi, legenda ultramatologiei, a participat, de asemenea, la activitatea școlii. În timpul său, în anii 1970, a dezvoltat un sistem de ascuțire a cuțitelor cu diamant, care permit producerea de secțiuni în serie de câteva zeci de nanometri în grosime. Gnagi a arătat cum să se ocupe cu cuțitele de diamant și cum să obțină tăieturi în serie cu ele.
În fotografie:
3. O secțiune transversală a capului Caenorhabditis elegans obținute folosind metoda cryofixation. Această lungime nematodele care trăiesc liber de aproximativ 1 mm lungime fost un model obiect preferat - primul organism pluricelular a cărui genom a fost complet decodat pe C. elegans studii au fost efectuate de proteina fluorescenta verde, un dispozitiv de vierme primitiv (adulți este format din doar 952 celule) a devenit prototipul pentru modelarea primului organism virtual (Courtesy T. Muller-Reichert și Kent McDonald)