Glicogenul este localizat în citoplasma celulelor și joacă un rol important în metabolismul energetic al celulelor. În studiul citochimic al glicogenului, reacția PAS sau reacția Schick (conform denumirii reactivilor - acidul Schiff-iodic) este folosită în principal.
Metoda Shabadash
Sub influența periodatului de potasiu, glicogenul este oxidat pentru a forma compuși aldehidici care reacționează cu ușurință cu reactivul Schiff (acidul fucsin-sulfuric). În locurile de localizare a glicogenului, se dezvăluie colorarea cireș-violetă, intensitatea căreia poate fi utilizată pentru a judeca cantitatea de glicogen din celule.
Vase și echipamente
- Pahare chimice cu o capacitate de 50 ml sau cuvetă.
- Cilindri de măsurare.
- Pipete graduate.
- Flacoane cu o capacitate de 250 ml.
- Pâlnie.
- Arzatoare.
- Termostat.
- Balanta.
- 0,03 M soluție de periodat de potasiu sau de sodiu: 230 mg de periodat se dizolvă în 100 ml de apă distilată. Pregătiți-vă înainte de consum.
- Reactivul lui Schiff: 1 g fuchsină de bază se dizolvă în 200 ml apă distilată la fierbere. Prin răcire, se adaugă la soluție 1 g de metabisulfit de potasiu și 20 ml de HCI 1N. soluție de acid clorhidric. Lasă pentru o zi. Pentru decolorarea completă, adăugați o tabletă de carbolină zdrobită, lăsați-o pentru o zi, apoi filtrați-o. Reactivul este ținut în întuneric (de preferință în frig) într-un recipient închis etanș. Este adecvat timp de câteva luni (o ușoară roșie indică inaplicabilitatea reactivului).
- Apă sulfuroasă: la 10 ml dintr-o soluție 10% de metabisulfit de potasiu, se adaugă 200 ml apă distilată și 10 ml acid clorhidric 1 N. soluție de acid clorhidric. Pregătiți-vă înainte de consum.
- Reactivul Shabadash: 1,8 g azotat de cupru, 0,9 g azotat de calciu și 10 ml formalină se adaugă la 100 ml de alcool etilic.
- 1 N. se adaugă o soluție de acid clorhidric (82,5 ml acid clorhidric concentrat cu greutate specifică 1,19 cu apă distilată până la 1 L).
- Soluție de alcool 0,1% de vopsea verde deschis (Lichtgrun).
Cursa de colorare
- Preparatele sunt fixate (imediat după preparare) într-un lichid de Shabadash în decurs de 30 de minute.
- Se spală în două trepte de apă distilată.
- Se înmoaie în perfuzie timp de 20 de minute (în întuneric).
- Se spală în trei trepte de apă distilată.
- Clătiți în apă sulfuroasă (timp de 1 până la 2 minute).
- Se lipește cu reactivul lui Schiff timp de 30-40 de minute (în întuneric).
- Se spală în trei schimburi de apă sulfuroasă timp de 3 minute.
- Se spală în trei trepte de apă distilată timp de 3 minute.
- Vopsea cu vopsea verde deschis timp de 10-20 secunde.
- Clătiți în apă distilată.
Pentru reacție, este convenabil să se pună toate soluțiile în cupe chimice sau cuve și să se transfere preparatele în secvența de mai sus.
În prezent există reactivi pentru studiul citochimic pentru glicogen din producția din fabrică, care sunt mai ușor de utilizat. Din păcate, nu toate sunt de bună calitate.
Rezultatul metodei Shabadash
Glicogenul este vopsit într-o culoare cireș-violet pe fundal verde al unui preparat.
Calculul cantității de glicogen se efectuează conform unei metode semi-cantitative sau exprimat ca procent.
În afară de glicogen, reacția pozitivă poate da astfel de substanțe PAS pozitive, cum ar fi neutre și acide mucopolizaharide, mucoproteins, glicoproteine și altele. Glicogen ușor diferențiate de alte substanțe cu proba de saliva sau diastaza.
Proba cu saliva
Medicamentul este plasat în salivă proaspătă și lăsat timp de 30 de minute într-un termostat. Apoi, glicogenul este colorat cu metoda de mai sus. Incubarea medicamentelor cu saliva promovează scindarea glicogenului și, în timpul reacției cu reactivul Schiff, culoarea roz nu apare.
Glicogenul poate fi, de asemenea, identificat prin pre-incubarea frotiurilor cu amilază (1 ml de amilază filtrată dizolvată în 40 ml de soluție salină) timp de 30 de minute într-un termostat.
În practică, o probă cu salivă nu este de obicei efectuată, astfel încât materialul PAS-pozitiv este de obicei înțeles ca toate polizaharidele, nu doar glicogenul.
Valorile normale ale metodei Shabadash
În frotiuri din sângele periferic de glicogen conținute în citoplasmă neutrofile (ca granulație fină abundentă), citoplasmă de limfocite (ca număr mic de boabe mari) și trombocitele (ca un singur bob mare). În țesutul osos punctiformă măduvă de glicogen detectate in neutrofile diferite grade de maturitate, limfocite și megacariocite.
În eozinofilele mature și bazofilele, materialul PAS-pozitiv este localizat după cum urmează: granulele specifice rămân necolorate și se evidențiază puternic în fundalul colorării difuze a citoplasmei.
În monocite, glicogenul este mai des detectat sub formă de granularitate asemănătoare prafului fin pe un fundal de colorare difuză roz deschis.
În mod normal, 3 până la 10% din celulele eritroide conțin mucopolizaharide.
În megacariocitele măduvei osoase, glicogenul este detectat sub formă de granule (de la un singur la 30-50), asemănător cu grupurile de plăci de sânge. La persoanele sănătoase, numărul de megacariocite cu glicogen-pozitiv este de 58,45 - 65,55%. În plachete, materialul PAS-pozitiv este detectat sub formă de granule mici împrăștiate de-a lungul periferiei celulei sau sub forma unui punct intens localizat central.
Semnificația clinică a metodei Shabadash
Conținutul crescut de glicogen în neutrofile este observată în diferite procese inflamatorii, eritremii, diabet, scădere - în cazul în care agranulocitoza, boli de iradiere, leucemie mieloidă cronică, în special în progresia procesului.
O creștere a numărului de limfocite pozitive pentru glicogen (până la 70-80%) este caracteristică bolilor limfoproliferative, în special leucemiei limfocite cronice.
Când purpură trombocitopenică și simptomatice număr trombocitopenie Forme glikogenpolozhitelnyh megacariocitelor redus semnificativ după splenectomie se ridică la valori normale.
In glicogen leucemii acute pot fi detectate în celulele blastice: în leucemie mieloidă acută sub forma de nisip fin în citoplasmă sau sub forma unei difuze slab colorarea acesteia și, explozii parțiale PAS-reacție este negativ. Cu leucemie acută promielocitară, se observă o colorare difuză difuză a citoplasmei. În reacția monoblastah poate fi negativ, slab pozitiv difuz sau difuz sub formă granulară (atunci când produsul de reacție este detectat sub formă de pelete mici sau mijlocii împrăștiate, care sunt situate de-a lungul marginii citoplasmă într-un fundal difuz). Când erythromyelosis granulele de glicogen din eritroblaștii observate sub formă de colorație difuză de intensitate variabilă - în normoblasts. Limfoblaste conțin glicogen în citoplasmă sub formă de granule mari și mijlocii jante aranjate în jurul miezului, uneori coalescente în blocuri pe fundal nevopsită. Numărul de celule cu astfel de caractere PAS-reacție variază pentru diferite cazuri de leucemie acută limfoblastică.
Cercetările cytochemice asupra glicogenului pot fi efectuate nu numai în frotiurile de sânge și în măduva osoasă. Astfel, de exemplu, este posibil să se studieze frotiurile epiteliului vaginal și, pe baza rezultatelor studiului, să se evalueze starea funcțională a ovarelor. În mod normal, se constată că femeile au o cantitate mare de glicogen în celule, în timp ce sărăcirea lor cu glicogen indică o încălcare a funcției ovarelor.
În tumori, cantitatea de glicogen este diferită: tumorile benigne mature conțin o mulțime de glicogen, iar în cazul tumorilor canceroase imature cantitatea de glicogen este redusă drastic. Reducerea glicogenului în celulele tumorale, probabil, poate fi utilizată ca indicator al tumorii maligne.
Micrografe ale reacției Schick:
Referințe:
Studiu cicito-chimic al mieloperoxidazei
Myeloperoxidaza este o enzimă lizozomală care catalizează oxidarea diferitelor substraturi în prezența peroxidului de hidrogen. Acesta este localizat predominant în granule azurofile specifice din citoplasma granulocitelor și este un marker al celulelor mieloide. Myeloperoxidaza este detectată în celulele seriei de granulocite, începând cu mieloblastul.
Studiu biochimic al lipidelor
Studiul citochemic al lipidelor se bazează pe utilizarea coloranților care se dizolvă în grăsimi (Sudan III, Sudan IV, Sudan negru, etc.). Pentru a identifica consumul neutru de grăsime Sudan III, colorați grăsimea în portocaliu. Lipoizii sunt detectați mai bine de negrul sudan (negru colorat).
Testul inelului Geller
Testul inelului Geller se referă la reacțiile calitative ale determinării proteinei în urină. Deoarece se bazează pe reacția de coagulare, urina studiată trebuie să îndeplinească anumite cerințe: să fie transparentă și să aibă o reacție acidă.
Numărărea mielocariocitelor
Pentru a număra mielocariocitele, punctatul măduvei osoase este diluat de 200 de ori. Pentru aceasta, se adaugă 0,02 ml punctat până la 4 ml dintr-o soluție de acid acetic de 3-5%. Conținutul tubului este bine amestecat și camera Goryaev este umplută. După uscarea elementelor formate (în 1 până la 2 minute), mielocarocitele sunt numărate în 100 de pătrate mari (similare numărului de leucocite din sângele periferic).
Morfologia celulelor germenului megacariocitic
Megacariooblastele sunt celulele ancestrale ale seriei megacariocitice. Dimensiunea este de aproximativ 20 μm. Miezul este rotund, cu o structură de cromatină cu granulație fină, uneori țesută sub formă de încurcătură. Structura nucleului este mai groasă decât cea a unei explozii nediferențiate, adesea sunt observate nucleoli. Citoplasma este bazofilă, neimprimată și are aspectul unei jante înguste. Deseori, contururile celulelor sunt inegale, cu procesele citoplasmei și formarea plăcilor "albastre".