Imunocitochimie: anticorpi policlonali și monoclonali
Interacțiunea antigenului cu anticorpul său este un exemplu de interacțiune foarte specifică între molecule. Din acest motiv, metodele care utilizează anticorpi marcați s-au dovedit a fi cele mai utile pentru identificarea și localizarea proteinelor și glicoproteinelor specifice.
Sunt celule în corp. care sunt capabili să distingă propriile lor molecule de cele externe. Ca răspuns la molecule străine cunoscute sub numele de antigeni, organismul produce o proteină - anticorp - care reacționează în mod specific cu antigenul și se leagă aceasta, facilitând astfel îndepărtarea materiei străine. Anticorpii sunt proteine aparținând unei familii care include numeroase imunoglobuline.
În studiile imunocitochimice, secțiunile de țesut (sau celule în cultură) care pot conține anumite proteine sunt incubate într-o soluție care conține anticorpi la această proteină. Anticorpii se leagă în mod specific la o proteină a cărei localizare poate fi urmărită cu un microscop luminos sau electronic, în funcție de tipul de compus utilizat pentru etichetarea anticorpilor.
Una dintre cele mai importante cerințe pentru metodele imunocitochimice este prezența anticorpilor la o proteină detectabilă. Aceasta înseamnă necesitatea pre-purificării și izolării acestei proteine, astfel încât să se poată obține anticorpi.
Anticorpi policlonali și monoclonali
Să presupunem că sarcina noastră este de a obține anticorpi la o proteină x a unui anumit tip de animal (de exemplu, un șobolan) sau la om. În cazul în care proteina x este deja izolată, aceasta se administrează unui animal dintr-o specie diferită (de exemplu, iepure sau capră).
Dacă proteina este atât de diferită încât animalul o recunoaște ca străină, i. E. ca un antigen, animalul va produce anticorpi la această proteină (de exemplu, anticorpi de iepure la proteină x șobolan sau capră proteină x anti-uman). Acești anticorpi sunt obținuți din plasma unui animal și utilizați în imunocitochimie.
Mai multe grupuri (clone) de limfocite ale animalului la care s-a introdus proteina x pot recunoaște diferite regiuni ale moleculei de proteină, fiecare grup producătoare de anticorpi la situsul corespunzător. Astfel de anticorpi policlonali sunt un amestec de anticorpi.
Cu toate acestea, este posibil să se lucreze cu proteina x, cu nalifocitele găsite în cultura celulară (de fapt, pe limfocitele combinate cu celulele tumorale). Clonele individuale de limfocite vor produce anticorpi diferiți la mai multe secțiuni ale proteinelor moleculare. Puteți izola fiecare clonă și o puteți cultiva - astfel încât anticorpi diferiți la proteina x pot fi obținuți separat.
Anticorpii obținuți în acest mod sunt anticorpi monoclonali. Există mai multe avantaje la utilizarea de anticorpi monoclonali față de exemplu policlonali, anticorpii monoclonali pot fi selectate pentru specificitate ridicată și activitatea de legare cu o proteină detectabilă. Prin urmare, va exista o legare mai puțin nespecifică la alte proteine similare cu cele studiate.
O metodă imunocitochimică directă se bazează pe utilizarea anticorpilor (monoclonali sau policlonali), care trebuie marcate cu eticheta corespunzătoare. Secțiunea de țesut este incubată cu anticorpi pentru o perioadă de timp, astfel încât anticorpii să interacționeze cu și să se lege de proteina x.
Tăierea este spălată în continuare pentru a elimina anticorpii nelegați. În funcție de eticheta utilizată (compus fluorescent, enzimă, particule de aur), tăietura poate fi examinată utilizând un microscop cu lumină sau electron.
Dacă se utilizează ca etichetă o peroxidază sau altă enzimă, această enzimă trebuie identificată înainte ca secțiunea de țesut să fie examinată sub microscop. Secțiunile de proteine care conțin tăieturi de țesut vor fluoresce, par a fi acoperite cu particule de aur sau cu sedimente întunecate dacă markerul ar fi o enzimă.
Metoda imunocitochimică indirectă are o sensibilitate mai mare, dar necesită mai multe etape. Să presupunem că scopul nostru este de a identifica proteinele prezente la șobolani. Înainte de efectuarea unei reacții imunocitochimice, trebuie efectuate două proceduri:
(1) este mai întâi necesar să se obțină anticorpi (policlonali sau monoclonali) pentru proteina x de șobolan la un animal dintr-o altă specie (de exemplu, iepure);
(2) În paralel, imunoglobulina iepurelui normal (neinjectat) este administrată la un animal dintr-o a treia specie (de exemplu, capră).
Imunoglobulinele de iepure sunt străine capre și, prin urmare, capabilă să inducă în animal producerea de anticorpi (anticorpi la anticorpi sau antiimmunoglobulinov).
Detecția imunocitochimică indirectă implică inițial incubarea unei tăieturi a unui țesut de șobolan care conține proteina x cu anticorpi de iepure la proteina x. După spălare, secțiunile de țesuturi sunt incubate cu anticorpi anti-iepure etichetați. Acești anticorpi la anticorpi se vor lega la anticorpi de iepure care au fost legați anterior la proteina x.
Proteina x poate fi apoi detectată utilizând o metodă microscopică corespunzătoare unei etichete care marchează anticorpii secundari. Există și alte metode indirecte care utilizează alte molecule intermediare, cum ar fi tehnica biotin-avidină.