Culturile culturilor de plante superioare
Tehnici de cultivare a celulelor unice din plante
Celule individuale sunt cultivate pentru a obține clone, studiind variabilitatea lor genetică și fiziologică sau stabilitatea lor. În plus, cultivarea celulelor individuale face posibilă studierea condițiilor care determină originea stimulilor pentru fisiune în celulele izolate de influența altor celule ale populației sau țesutului. Celulele individuale sunt, de asemenea, importante pentru selecția clonală a liniilor mutante, hibride și transformate. În mod obișnuit, astfel de celule sunt introduse cu gene marker care permit selectarea.
În plus, celulele individuale pot servi ca model pentru studiul comparativ al proceselor fiziologice în țesut și o celulă izolată. De exemplu, pentru a studia fotorespirația, se poate compara procesul de fotosinteză la nivelul celulelor mezofile individuale ale frunzelor și țesutului întreg.
Cultivarea celulelor izolate constă în două etape: 1) izolarea celulelor intacte de țesut de plante sau de calus; 2) crearea condițiilor favorabile creșterii și dezvoltării unei celule izolate.
În prima etapă, este necesar să se identifice o celulă intactă și viabilă din țesutul întregii plante sau țesut de calus. Acest lucru poate fi obținut prin prelucrarea țesutului cu pectinaze, ceea ce duce la macerarea celulelor sale. Cu toate acestea, nu întotdeauna după un astfel de tratament, celulele își păstrează capacitatea de divizare și de formare a țesuturilor ulterioare. Este mai bine să obțineți celule individuale din culturi de suspensie sau calus vrac. Celulele individuale ideale sunt protoplastele care au format peretele celular.
Celulele sunt apoi izolate fie prin micromanipulatori, fie printr-o serie de diluții succesive. La primele încercări de a cultiva celule individuale, a apărut o problemă științifică importantă: cum se împart celulele divizate de influența altor celule din populație sau de țesuturi? Celulele individuale s-au comportat diferit decât agregatele lor sub formă de agregate în suspensie sau masa de calus pe suprafața mediului nutritiv.
Când a fost rezolvată, a apărut o ipoteză despre "factorul de condiționare". Acesta a fost numele unei substanțe care stimulează divizarea celulelor individuale. Stabilit că acest factor este de natură chimică, termolabile, este solubil în apă, nizkomolekulyaren (MK Pavlova, RG Butenko, 1965), vidonespetsifichen, nu un substitut pentru fitohormoni bine cunoscute, sinergichen cu brassinosteroids. S-au propus mai multe variante de cultivare a celulelor individuale.
În 1954, Muir, Hildenbrant și Riker au reușit să găsească condițiile potrivite pentru împărțirea celulelor individuale. Această metodă a fost numită metoda "țesutului - asistent" (Figura 12).
Fig. 12. Schema de utilizare a calusului ca "țesut asistent"
Cell izolat folosind un micromanipulator călușului friabil direct cu piesa de filtru 8 * 8 mm, plasată deasupra calusului din care celula a fost derivată. Calusul trebuie să se afle în faza de creștere activă. De asemenea, puteți utiliza țesutul de calus dintr-o altă plantă dintr-o specie asemănătoare ca o "bona". În acest caz, celulele cresc și se împart. Pe măsură ce îmbătrânește asistenta calus, filtrul cu celule este transferat la calusul tânăr. Când țesutul din celulă atinge o dimensiune de 0,5 - 1 mm, acesta poate fi plantat direct pe mediul nutritiv.
Au fost efectuate prin precipitarea experimentelor de celule direct pe mediul de agar, dar nu neapărat lângă filtru, care, în câteva zile, în contact cu un tânăr țesut calus în creștere rapidă. Deoarece aceste studii au arătat că o celulă constantă este pusă în contact cu un filtru cu masa calus nu este necesară pentru diviziunea celulară, sa sugerat să folosească mediul de cultură vechi pentru stimularea unei singure celule pentru a diviza.
De asemenea, puteți utiliza metoda "stratului de îngrijire medicală". Pentru a face acest lucru, luați o suspensie de celule din aceeași specie ca o singură celulă sau o specie apropiată. Suspensia celulară trebuie să se afle în faza exponențială timpurie a ciclului de creștere. În 1959, Bergman a propus să filtreze cultura suspensiei (în experimentele sale a fost tutun și fasole) sterile printr-un strat de cambrică (celule 0,3 x 0,1 mm). Ca rezultat, s-a obținut o suspensie, care a constituit 90% din celule individuale. Această suspensie a fost amestecată cu un mediu de agar cu aceeași compoziție ca și în cultivarea suspensiei (mediul a conținut agar de 0,6%). Amestecul a fost turnat într-un strat subțire (1 mm) în vase Petri. Agarul a separat celulele, dar nu a împiedicat schimbul de semnale chimice între ele, iar grosimea stratului le-a permis să aibă grijă de comportamentul lor sub microscop.
Inducerea divizării celulelor individuale este posibilă atunci când se utilizează un mediu nutritiv foarte bogat, de exemplu, mediul Kao și Mikhailuk. În același timp, volumul mediului în care sunt plasate celulele trebuie să fie minim (microdroplets până la 20 μl în volum).
Toate aceste metode de cultivare permit celulei să "simtă" factorul de condiționare. Acesta este fie produs într-o cantitate suficientă de celule „strat alăptează“, „tesatura - asistentă“ sau conținute într-o suspensie în care celulele cultivate de mai sus, sau nu se pierde un volum mare de mediu. Astfel, factorul care provoacă diviziunea celulară este produs de celule în sine, dar într-o cantitate mică. Numai prin creșterea numărului de celule care produc acest factor este faptul că aceasta nu se disipeze cantități mari de mediu nutritiv sau reducerea volumului mediului în care celulele sunt cultivate este, puteți obține-o pentru a partaja.
Alte capitole ale secțiunii: