Introducerea genei în celulă
Tipuri de vectori pentru introducerea unei gene într-o celulă
Există mai multe tipuri de vectori:
Cea mai mare parte a ADN-ului celulelor bacteriene este conținută în cromozom (în cromozomul E. coli, de exemplu, 4 milioane de perechi de nucleotide). Cu toate acestea, în plus față de cromozomi, bacteriile conțin un număr mare de molecule ADN circulare foarte mici de plasmide, cu câteva mii de perechi de baze lungi (greutate moleculară de la 1,5 la 300 megadaltoni, 1 MD = 1500 bp). Astfel de mini-cromozomi se numesc plasmide.
De obicei, plasmidele sunt compuse din gene rezistenta la antibiotice, ioni de metale grele (R-plasmide), precum și gene care controlează catabolismul anumiți compuși organici (plasmid biodegradare sau D-plasmid). Deoarece aceste gene sunt plasmidice, ele sunt reprezentate de un număr mult mai mare de copii. copiere de mare număr plasmide furnizează o sinteză celulară a unei cantități mari de enzime, antibiotice sau xenobiotice chimic neutralizanți și care oferă o rezistență la acesta din urmă. Plasmidele, aparent omniprezente, deoarece acestea sunt izolate din diferite tulpini și specii de bacterii, dar sunt componente opționale ale genomului, iar in unele tulpini de plasmide naturale nu a fost găsit deloc.
Deoarece ADN-ul plasmidic este mult mai puțin cromozomal, este destul de ușor să-l separăm în formă pură. În prezența ionilor de calciu, plasmidele sunt ușor absorbite de bacteriile destinate, chiar dacă acestea nu au fost niciodată conținute și multe copii ale plasmidei absorbite pot fi găsite în celulele descendenților bacterieni. Cu toate acestea, celula bacteriană poate conține de obicei plasmide de același tip. Acest fenomen de incompatibilitate a plasmidelor. Există grupuri de incompatibilități - Inc-grupuri (de la incompatibilitatea engleză - incompatibilitate). În acest grup pot exista mai multe plasmide compatibile între ele, dar nu sunt compatibile cu alte plasmide. Aceste plasmide prezintă multe dintre caracteristicile și, adesea, o omologie semnificativă a ADN-ului.
Numărul de copii ale plasmidei din celulă poate varia semnificativ. Aceasta depinde de caracteristicile genetice ale celulelor și ale plasmidelor. Plasmidele care sunt "sub controlul slăbit" se pot multiplica până când numărul lor ajunge la 10-200 copii pe celulă. Dacă plasmida este "sub control strict", ea se replică la aceeași rată ca și cromozomul principal. Astfel de plasmide sunt conținute în celulă într-una sau mai multe copii. În mod natural, plasmidele de primul tip sunt utilizate pentru clonarea ADN-ului recombinant. Dar acest lucru nu este necesar, deoarece plasmidele în prezența cloramfenicolului se pot multiplica independent de diviziunea cromozomului, iar numărul de copii ale plasmidei se poate multiplica.
Unul dintre cele mai frecvent utilizate plasmide pentru clonarea pBR 322 se bazează pe plasmide de origine naturală izolate din E. coli. Această plasmidă conține gene rezistente la două antibiotice: ampicilină și tetraciclină, iar în genele de rezistență la aceste antibiotice există situsuri de restricție. Dacă un fragment de ADN străin este inserat într-unul dintre genele de rezistență, atunci acesta din urmă este inactivat. În consecință, integrarea cu succes a unui fragment de ADN străin într-una din aceste gene poate fi ușor detectată prin dispariția rezistenței la un antibiotic dat în bacterii. Dar, în același timp, rezistența la un alt antibiotic rămâne. Astfel, vectorul face posibilă detectarea numai a acelor clone de bacterii care conțin plasmida recombinantă.
Există viruși care nu duc la moartea celulară, ci sunt încorporați în genomul celulei gazdă și se înmulțesc cu ea sau o fac să crească necontrolat, adică transforma în cancer. Acestea includ virusurile SV-40 ADN și virusul polyoma. Introducerea unor virusuri ale ARN-ului tumoral duce la înmugurirea particulelor virale din celulă fără liza. Astfel de viruși includ, de exemplu, retrovirusuri (virusul sarcomului Rous și SIDA). Bacteriofagii sunt adesea utilizați ca vector pentru celulele bacteriene.
Virușii sunt unul dintre principalii candidați pentru rolul vectorilor pentru introducerea ADN străin. Cu o infecție virală, fiecare celulă poate obține un număr mare de copii ale unei gene străine. ADN-ul poate fi inserat în așa fel încât acesta să fie sub controlul promotorilor virali puternici, ceea ce va asigura un nivel ridicat de exprimare a genelor, iar produsele sale vor fi mai accesibile pentru cercetare.
In ultimii ani, numeroase „transfer“ vectori concepute și derivații lor recombinante care sunt capabile de replicare într-o celulă animală și bacteriene și exprimarea eficientă a genei donate într-o celulă de animal. Cele mai comune vectori constau din plasmidă pBR322 și intactă regiunea timpurie SV40 transcrierea ADN-ului, gena este integrată sub controlul unui promotor sau gene tardive promotor timpuriu suplimentar. De exemplu, în AD40 SV40 o genă #globina de iepure, care a fost exprimată în linia celulelor de maimuță infectate cu un virus recombinant: celulele sintetizate atât ARNm al genei globinei, cât și proteina în sine.
Virusul trebuie să fie viabil după recombinarea ADN-ului său. Virușii sunt cel mai ușor introduși în bacterii. Dezavantajul virușilor ca vectori este capacitatea lor mică. În plus, virușii infectează un cerc mic de gazde.
Există vectori hibrizi care conțin ADN fag și plasmide. Acestea includ, de exemplu, cosmidele și phasmidele.
Cosmide - vectori plasmidici, în care este încorporată secțiunea genomului fagului # 955; care oferă posibilitatea ambalării acestei molecule ADN într-o particulă de fag. Particulele de fagă asigură o bună penetrare a ADN-ului hibrid în celulă (prin injecție), după care ADN-ul este înfășurat în inel la capetele lipicioase și replicat la tipul de plasmidă.
Fasmidele sunt, de asemenea, hibrizi între fag și plasmidă. După inserarea ADN străin, în anumite condiții se pot dezvolta fagi, în timp ce în altele se pot dezvolta ca plasmide.
Dintre toți agenții infecțioși cunoscuți în prezent, au rangul cel mai ciudat. Se știe că cei mai mici virusuri, capabili de replicare independentă, au dimensiuni genomice corespunzătoare unei mase moleculare de 1 M, adică aproximativ 1500 mii de perechi de baze. Aceasta a fost considerată cantitatea minimă de informații genetice necesare pentru codificarea produselor specifice virusului și suprimarea metabolismului celulei gazdă.
Cu toate acestea, in 1971 agenti godu infectiosi au fost deschise, sunt foarte scurte de lanț 1 ARN catenar legat covalent la un inel constând din nucleotidele 270-300 (trei ordine de mărime mai mică decât virusul cel mai minimal) care nu sunt închise într-un strat proteic. Acestea sunt agenți patogeni neobișnuiți - cei mai simpli și mai mici dintre toți cei cunoscuți.
Modul în care viroizii produc simptome de boală în plantele infectate nu este cunoscut până acum. Se constată că ele sunt replicate de enzimele celulelor gazdă, nu sunt translatate în polipeptide specifice speciilor, se integrează în genomul celulei gazdă.
Viroizii infectează persistent (nu există recuperare). Din cauza unei infecții sistemice, adică migrează din locul implantului în alte părți ale plantei, transportate mecanic sau prin sucul celular, prin semințe, polen. Viroizii sunt, de asemenea, asociați cu fracțiile de plante nucleare și se pot multiplica în nuclee.
Când se lucrează cu viroizi, se obține o copie de ADN 1-catenară a ARN și se completează o catenă complementară pentru a obține un ADN 2-catenar al viroidei. Acest ADN 2-catenar este inserat în plasmidă și transferat în celulele E. coli pentru clonare. Gena este citită din promotor, care este recunoscut de ARN polimeraza, care este responsabilă pentru transcrierea ADN-ului în șablonul ARN. De obicei, este un fragment de ADN de 41-44 perechi de baze. Gena este citită de la stânga la dreapta, de la capătul 5 'la 3' al genei și se termină în regiunea terminală a genei. În spatele promotorului începe situsul inițial al transcripției, urmat de partea semantică a genei. Regiunea promotor a genei conține anumite combinații scurte de nucleotide caracteristice pentru genele bacteriene sau pentru genele organismelor superioare. Astfel de combinații servesc ca semnale pentru polimeraza ARN, care este atașată la partea promotor a genei și începe să fie citită.
ADN-ul monocatenar și dublu catenar pot iniția replicarea viroidă în plantele de tutun inoculate mecanic. Enzymatic in vitro a sintetizat, de asemenea, viroide ARN, extrem de infecțioase pentru plante. Sistemele vectori pot fi dezvoltate pe baza ARN-ului în sine, pe baza ADN-ului specific virei, precum și într-o combinație de ADN specific virei cu plasmide Ti. Virozii infectează gazdele lor pe tot parcursul ciclului lor de viață, astfel încât, în cazul utilizării sistemelor vectoriale viroide, se poate aștepta o expresie constantă a unei gene străine în plantă.
Plasmidele bacteriene care formează tumori pot fi utilizate ca vectori. Speciile Agrobacterium sunt legate în mod evolutiv de bacteriile din noduli aparținând genului Rhizobium și au multe caracteristici comune cu acestea. Cu toate acestea, natura interacțiunii agrobacteriilor cu planta are trăsături specifice.
Interacțiunea specie Agrobacterium la plante este de interes deosebit, deoarece atunci când acest tip de parasitism un partener specific modifică proprietățile gazdei prin inserarea genelor lor în genomul său. În plus, servește ca un exemplu unic de migrare a ADN-ului procariotic la o celulă eucariotă. ADN-ul mitocondrial si cloroplast cloroplaste si mitocondrii contin un sistem genetic complet, adică toate componentele necesare pentru exprimarea informației genetice: ADN, ADN polimerază, ARN polimerază și mașinile-sintetizarea proteinelor (ribozomi, ARNt, aminoacil-ARNt sintetaza).
ADN-ul cloroplastic și mitocondrial atrage atenția oamenilor de știință ca vectori posibili pentru transferul de gene în celulă. Organizarea structurală a acestor subgenomii celulari variază considerabil.
Cloroplastele și alte plastide au aceleași informații genetice, așa-numitul plastome. În plantele superioare, este o moleculă de ADN închisă cu o lungime de 150 de tone. suficient pentru a codifica aproximativ 100 de proteine. Pentru a sintetiza plastidele, sunt necesare mai multe proteine. Celelalte proteine sunt codificate de miez, sunt sintetizate în citoplasmă și introduceți cloroplaste. Unele dintre proteine cheie cloroplastici sunt compuse din mai multe subunități, unele dintre ele sunt sintetizate pe ribozomi de citoplasmă și este transportat în cloroplast, unde acestea sunt combinate cu alte polipeptide codificate în cloroplast și în același sintetizat. Astfel, pentru biosinteza genomului din cloroplaste activă funcțional necesită exprimarea coordonată și plastome.
Diferitele tipuri de plastide conțin cantități inegale de copii identice ale plastomei: de la 10 la 20 de copii în plastide de rădăcini și cloroplaste mature până la sute de exemplare în cloroplastele de cartof tineri. Acest nivel de amplificare ne permite să sperăm pentru exprimarea fiabilă a ADN-ului străin atunci când este utilizat ca vector în experimentele de inginerie genetică. În plus, genele de plastide ARN ribozomale și subunitățile mari de RBC sunt codificate de genomul cloroplastelor. Poate că introducerea de promotori puternici în aceste gene și modificarea lor suplimentară vor afecta în mod semnificativ activitatea fotosintetică a țesutului vegetal.
Genele de plantă sunt, de asemenea, capabile de exprimare în celulele E. coli. Aceste gene sunt o subunitate mare de RBC. Avantajul genelor cloroplastice este acela că expresia lor la celulele Escherichia coli poate fi realizată prin simpla combinare a secvențelor transcrise. În ADN-ul cloroplastelor și bacteriilor, aceeași secvență de nucleotide este localizată înainte de începerea codonilor de start de translație. Acest lucru face posibilă sinteza polipeptidelor importante din punct de vedere economic pe bază de plante de către celule procariote.
Spre deosebire de cloroplast, ADN-ul mitocondrial se caracterizează printr-o varietate excepțională, iar mărimea acestuia variază de la 200 la 2400 de tone. etc. Cu toate acestea, nu există nici o corelație între dimensiunea genomului mitocondrial și numărul de produse proteice sintetizate prin mitocondriile izolate. Acest fenomen, precum și mărimea mare a ADN-ului mitocondrial, se poate explica aparent prin prezența ADN-ului, care este inutil pentru funcționarea mitocondriilor.
Structura ADN-ului mitocondrial conține gene structurale care codifică polipeptide, gene de ribozomal și ARN de transport. Cu toate acestea, majoritatea proteinelor mitocondriale, cum ar fi cloroplastele, sunt codificate de genele nucleare. Dar dacă genomul de cloroplaste este reprezentat de o populație omogenă de molecule mari de inel, atunci în mitocondrii există mai multe clase de molecule inel, nu toate ale căror funcții sunt încă clare.
Genomul mitocondrial al organismelor animale este mult mai mic, de la 15 la 19 tone. etc și mai conservatoare în structură. Genele mitocondriale codifică două grupe de semne - activitatea sistemelor respiratorii și rezistența la antibiotice și alte otrăvuri. În genomul mitocondrial al plantelor, există, de asemenea, gene responsabile pentru semnul sterilității masculine a citoplasmei.
Transposonii sunt segmente ale ADN-ului care controlează propria lor transpunere (mișcare) de la un sit ADN la altul prin tăierea de la locul inițial și inserarea unui cromozom sau plasmidă într-un sit nou. Pentru prima dată au fost descoperite în anii '40 de către omul de știință american Barbara McClintock din porumb. Aceste gene, identificate prin capacitatea lor de a suprima expresia altor gene de porumb adiacente acestora, nu au avut o pozitie fixa pe cromozom. Păreau să se miște în jurul întregului genom al plantei. Elementele de reglementare ar putea fi construite și despicate, iar după desprinderea lor, genele anterior silențioase au început să funcționeze adesea.
Sa dovedit că genele asociate cu elementele de reglementare au devenit instabile și adesea mutate din cauza instabilității acestor elemente. Timp de mulți ani, porumbul a rămas singurul sistem în care s-au găsit astfel de elemente genetice mobile. Acum - și bacterii, Drosophila și alte organisme.
Mecanismul de mutare a fragmentelor de ADN peste genom nu este pe deplin înțeles. ADN-ul este transferat de către enzima transposază. Enzima este codificată de o secvență de aproximativ 20 de nucleotide în mijlocul transpozonului. Acesta interacționează în mod specific cu repetările terminale inversate ale elementului mobil și îl poate decupla din cromozom. Tăierea poate apărea tocmai - cu restabilirea structurii originale a regiunii ADN și este inexactă, adică cu deleții și inserții de la una la mai multe nucleotide. Aceasta conduce la apariția mutațiilor stabile și este unul dintre mecanismele de creare a secvențelor ADN noi.
De regulă, elementele genetice mobile sunt repetate în mod repetat în genom și formează familii eterogene ale căror membri sunt dispersați pe cromozomi. Majoritatea membrilor fiecărei familii sunt copii defecte și nu codifică nicio funcție, deși își păstrează capacitatea de a se deplasa. Comportamentul transpozonilor poate fi privit ca fiind parazit. Lungimea lor este cuprinsă între 2 și 10 mii perechi de nucleotide. În eucariotele superioare, proporția de transpozoni reprezintă aproximativ 10% din ADN-ul celulei. Cele mai multe dintre ele se mișcă ocazional, dar, deoarece sunt destul de puține în celulă, transpunerea are un efect semnificativ asupra diversității speciilor.
Sensul biologic al mișcării segmentelor ADN individuale:
- întreruperea genei corespunzătoare, ceea ce duce la evoluție;
- reglementarea activității genelor, deoarece transposonii pot transmite semnale pentru a începe citirea genelor. În domenii noi, activitatea genei este întărită sau interzisă.
Transposonii sunt de asemenea implicați în transferul orizontal al genelor.
La bacterii s-au găsit două clase de gene mobile, care diferă în funcție de lungimea și complexitatea organizației.
1. Secvențe de inserție sau elemente 1S, având o lungime de aproximativ o mie de perechi de nucleotide și conținând numai gena responsabilă pentru mișcarea lor.
2. Transpoziții, cu o lungime de 3 până la 20 de tone. etc., constând dintr-un număr de gene suplimentare responsabile pentru rezistența bacteriilor la diverse substanțe toxice.
Deoarece genele mobile se pot mișca în genomul de la un loc la altul, ele pot fi vectori foarte eficienți pentru transmiterea ADN-ului recombinant. Transformarea genetică utilizând vectori bazați pe transpozoni a fost efectuată mai întâi pe Drosophila. Cu ajutorul elementului transposibil D al lui Drosophila, gena responsabilă de culoarea brună a ochilor a fost transferată. Transferul genei cu ajutorul transpozonilor prezintă avantaje mari, deoarece are loc la o frecvență înaltă și nu implică rearanjări semnificative ale ADN integrabil. În plus, această metodă poate purta fragmente ADN destul de mari.
Alte capitole ale secțiunii: