4. Reacțiile de sedimentare a proteinelor
Proteinele în soluție și, în consecință, în organism rămân în starea nativă datorită factorilor de stabilitate, care includ sarcina moleculei de proteină și a coajei hidratate din jurul acesteia. Eliminarea acestor factori duce la lipirea moleculelor de proteine și la precipitarea lor. Precipitarea proteinelor poate fi reversibilă și ireversibilă, în funcție de reactivi și de condițiile de reacție. In laborator clinic de reacție practică de precipitare utilizată pentru a izola albumine și globuline fracțiuni ale proteinelor plasmatice din sânge, cuantificarea caracteristicilor lor de stabilitate în plasmă, detectarea proteinelor în fluide biologice și să le elibereze pentru a obține, fără o soluție de proteină.
Sub influența factorilor de precipitare, proteinele precipită, dar după terminarea (îndepărtarea) acestor factori, proteinele devin din nou solubili și dobândesc proprietățile lor native. Unul dintre tipurile de precipitații reversibile ale proteinelor este sărăcia.
Salting out. Cu o soluție saturată de sulfat de amoniu, se precipită fracțiunea de albumină din proteine, iar fracția de globulină este o soluție semi-saturată.
Esența reacției este deshidratarea moleculelor de proteine.
1) albus de ou nediluat;
2) o soluție saturată de sulfat de amoniu;
3) NaOH, soluție 10%
4) CuSO 4; soluție 1%;
5) apă distilată;
6) sulfat de amoniu în pulbere.
Cursul definiției. Într-un tub de testare, se toarnă 30 de picături de ou nediluat și se adaugă o cantitate egală de soluție de sulfat de amoniu saturată. Conținutul tubului este amestecat. Se obține o soluție semisaturată de sulfat de amoniu, cu precipitarea fracției de globulină și fracția de albumină rămâne în soluție. Acesta din urmă este filtrat, apoi este amestecat cu pulbere de sulfat de amoniu până când dizolvarea sării încetează, cu un precipitat de globuline.
Precipitarea ireversibilă a proteinelor.
Prelungirea ireversibilă a proteinelor este asociată cu tulburări profunde în structura proteinelor (secundare și terțiare) și pierderea proprietăților lor native. Astfel de modificări în proteine pot fi cauzate de fierbere, acțiunea soluțiilor concentrate de acizi minerali și organici, săruri ale metalelor grele.
Precipitarea la reflux.
Proteinele sunt compuși termolabile și, atunci când sunt încălzite la o temperatură de peste 50-60 grade C, sunt denaturate. Esența denaturației termice este distrugerea cochilatului de hidrat, ruperea globulei proteice stabilizând legăturile și desfășurarea moleculei de proteine. Cea mai completă și rapidă precipitare are loc la punctul izoelectric (când sarcina moleculei este zero), deoarece particulele de proteine sunt cel mai puțin stabile în acest moment. Proteinele cu proprietăți acide sunt precipitate într-un mediu slab acid, iar proteinele cu proprietăți de bază sunt ușor alcaline. În soluții puternic acide sau puternic alcaline, proteina denaturată atunci când este încălzită nu precipită în precipitat. particulele sale sunt reîncărcate și poartă în primul caz un efect pozitiv, iar în cel de-al doilea - o sarcină negativă, care le sporește stabilitatea în soluție.
1) albus de ou, soluție 1%;
2) soluții de acid acetic, 1% și 10%;
3) NaOH, soluție 10%.
Cursul definiției. În 4 tuburi numerotate, se adaugă 10 picături de soluție de ou alb. Apoi, primul tub este încălzit până la fierbere, în timp ce soluția devine turbidă, ci pentru că particulele proteinei denaturate poartă o încărcătură, nu precipită. Acest lucru se datorează faptului că proteina din ou are proprietăți acide (punctul său izoelectric este de 4,8) și este încărcat negativ într-un mediu neutru; 1 picătură de soluție de acid acetic 1% se adaugă la al doilea tub și se încălzește la fierbere. Proteina precipită. soluția sa abordează punctul izoelectric și proteina își pierde sarcina (unul dintre factorii de stabilitate a proteinei din soluție); adăugați 1 picătură de soluție de acid acetic 10% la cel de-al treilea tub și încălziți până la fierbere. Proiectul nu este format, t. într-un mediu puternic acid, particulele de proteine dobândesc o încărcătură pozitivă (unul din factorii de stabilitate proteică din soluție este reținut); în cea de-a 4-a eprubetă, se toarnă o picătură de soluție de NaOH, încălzită la fierbere. Sedimentul nu este format, deoarece în mediul alcalin crește încărcătura negativă a proteinei.
Precipitarea cu acizi minerali concentrați.
Acizii concentrați (sulfuric, clorhidric, nitric etc.) determină denaturarea proteinelor datorită îndepărtării factorilor de stabilitate a proteinei în soluție (încărcătura și stratul de hidrat). Cu toate acestea, cu un exces de acid clorhidric și sulfuric, precipitatul precipitat al proteinei denaturate se dizolvă din nou. Aparent, acest lucru are loc ca urmare a schimbului de sarcină al moleculelor de proteine și a hidrolizei parțiale a acestora. Atunci când se adaugă acid azotic în exces, nu se produce nici o precipitare. Acesta este motivul pentru care acidul azotic este utilizat pentru a determina cantități mici de proteine în urină în studiile clinice.
1) albus de ou, soluție 1%;
2) acid sulfuric concentrat;
3) acid clorhidric concentrat;
4) acid nitric concentrat.
Cursul definiției. În trei eprubete se toarnă 5 picături de acid sulfuric concentrat, acid clorhidric și azotic. apoi, înclinarea tubului la un unghi de 45 de grade, ușor de-a lungul stratului de perete, același volum de ou alb. Un precipitat de proteine apare la limita celor două straturi ca un inel alb. Se agită ușor tuburile de testare, se observă dizolvarea proteinei în eprubete cu acid sulfuric și acid clorhidric, într-un tub de testare cu dizolvare a proteinei acidului azotic nu se produce.
Precipitarea cu acizi organici.
Acidul tricloroacetic precipită numai proteine, iar sulfosalicilul precipită nu numai proteine, ci și peptide cu moleculă înaltă. Acidul sulfosalicilic este utilizat în determinarea proteinei în urină.
1) albus de ou, soluție 1%;
2) acid tricloracetic, soluție 10%;
3) acid sulfosalicilic, soluție 10%.
Cursul definiției. În două eprubete, se adaugă 5 picături de soluție proteică. În unul dintre ele se adaugă 2 picături de acid sulfosalicilic, iar în cealaltă - 5 picături de acid tricloroacetic. În tuburile de testare a fost precipitat proteina.
Precipitarea proteinelor cu săruri ale metalelor grele.
Proteinele interacționează cu sărurile de plumb, cupru, mercur, argint și alte metale grele și sunt denaturate și precipitate. Cu toate acestea, cu un exces de unele săruri, se observă dizolvarea precipitatului format inițial. Aceasta se datorează acumulării de ioni metalici pe suprafața proteinei denaturate și apariția unei încărcături pozitive asupra moleculei de proteine.
1) albus de ou, soluție 1%;
2) sulfat de cupru, soluție 10%;
3) acetat de plumb, soluție 5%;
4) azotat de argint, soluție 5%.
Cursul definiției. În trei eprubete se adaugă 5 picături de proteină. În prima se adaugă o picătură de acetat de plumb, în a treia - o picătură de azotat de argint. Un precipitat este depozitat în toate epruvetele. Apoi, 10 picături de azotat de argint sunt adăugate la primul tub de testare - nu există nici o dizolvare a precipitatului.