Ambalare în lipozomi
Prin transfectarea ADN-ul adsorbit pe cristale de fosfat de calciu (Graham Van der Eb, 1973). Particulele sunt formate din precipitat de calciu. Ele sunt absorbite de către celula de fagocitoză.
Pentru a îmbunătăți eficiența de conversie a ADN-ului specific care conține gena, prin care se face este adăugat ADN purtător nespecific selecție. De obicei, în acest scop, prelevarea de ADN de la timus de vițel sau de spermă de somon. O parte din ADN-ul se leagă la membrana si nu intra in celule. ADN-ul acceptă 15-90% din celule. La câteva zile după administrarea unei fracțiuni mici de celule capabile să exprime gene străine, nivelul de expresie, dar apoi scade transformare mai mult sau mai puțin stabilă suferă 10 -3-10 -5 celule.
Pentru transfecție folosind DEAE-dextran și ADN-ul polimer adsorbante. Efectul intrării celulelor și care exprimă timp frecvență de transformare ridicată, dar stabilă, este mai mică decât cu precipitat de calciu. Frecvența transfecției crește șoc glicerol (4 minute în soluție de glicerol 15% în tampon NEPES).
Celulele pot fi administrate la orice genă dacă pre-l cu un marker ligat selectabil clonat. Cu toate acestea, studii suplimentare au arătat că legarea celulelor nu este necesară. Celulele care absorb gena selectivă împreună cu ea și pot absorbi un alt ADN care are un precipitat de calciu. Astfel, folosind metoda cotransformare. practic orice segment de ADN clonat poate fi inserat în celule eucariote cultivate dacă permit acest ADN, împreună cu marker selectabil în amestec pentru formarea de precipitat de calciu.
Transfecția pot fi utilizate fragmente de cromozomi sau cromozomi. Celulele donatoare au fost blocate în faza de mitoză. cromozomi mitotice sunt eliberați sub influența șocului osmotic și omogenizare. Acestea au fost purificate prin centrifugare diferențială. Cromozomii sunt depozitate pe suprafața celulelor cu clorură de calciu, iar câteva ore mai târziu, tratat cu un reactiv capabil de membrană perforată (de exemplu, glicerol).
Pentru tratarea celulelor primitoare sunt folosite, preparatele aproximativ purificate de cromozomi, astfel ca cromozomi, astfel distruse puțin. Numărul de cromozomi pentru procesarea o singură celulă este limitată. Este mai bine să nu folosiți mai mult de 20 de cromozomi 1 celulă retsepient, deoarece la concentrații mari de cromozomi în suspensie au aglutinează. celulă donor Retsepientnaya conține fragmente de cromozomi care pot fi integrate în genomul poate replica în mod independent. În pasajele de mai sus sunt adesea observate eliminări.
Nu toate celulele sunt capabile de a transforma ADN-ului genomic la o frecvență ridicată. fibroblaste umane pentru a include în mod eficient ADN-ul plasmidic și aproape nu includ genomica.
Microinjectarea ADN în celule de mamifere, a devenit posibilă odată cu apariția instrumentului de fabricație a diametrului micropipete de 0,1-0,5 microni și un micromanipulator (Fig. 45). Astfel, o plasmidă care conține un fragment al genei virusului herpes timidin kinază (TK) și plasmida pBR322, au fost injectate în TC - și celulele p sa demonstrat că TC - gena a pătruns în miez și în mod normal, reprodus în acesta. Metoda de introducere a ADN folosind micro-injecție a fost dezvoltat la începutul anilor '70 de către Anderson și Diakumakosom. Practic, dacă aveți bun echipament poate fi injectat 1 oră 500-1000 celule, iar în cele mai bune experimente in 50% din celule se observă integrarea stabilă și expresia genei injectat. Avantajul metodei descrise constă și în faptul că permite să se introducă orice ADN în orice celule și pentru a menține gena introdusă în celulele nu necesită nici o presiune selectivă.
Fig. 45. Introducerea ADN prin microinjecție
Electroporarea se bazează pe faptul că impulsuri de înaltă tensiune pentru a crește în mod reversibil permeabilitatea membranelor biologice. Miercuri, sunt adăugate celule electroporare și fragmentele de ADN pentru a fi introduse în celule (Fig. 46). Prin intermediul trece impulsuri de înaltă tensiune (tensiune 200-350 V, 54 ms lungimea impulsului), având ca rezultat formarea de pori (elektroproboy) în membrana citoplasmatică, durata de viață și care este de mărime suficientă pentru astfel de macromolecule, cum ar fi ADN-ul, poate intra in celula din mediul extern ca rezultat al forțelor osmotice. Volumul celulei creste.
Intensitatea câmpului electric și durata acțiunii, concentrația de transformare a celulelor ADN și primitoare pentru fiecare sistem de celule experimental este selectat astfel încât să se obțină un procent ridicat de asimilare ADN de către celulele care au supraviețuit. Sa demonstrat că, în condiții optime numărul electroporation transformanti poate ajunge la 80% din celulele care au supraviețuit.
Electroporarea - metoda fizică, mai degrabă decât biochimice, iar acest lucru este, probabil, din cauza utilizării sale pe scară largă. Numeroase studii au demonstrat că electroporarea pot fi utilizate cu succes pentru a introduce molecule de ADN in diferite tipuri de celule, cum ar fi culturile de celule animale, protozoare, drojdii, bacterii și plante protoplaști. Electroporat efect de descărcare de înaltă tensiune pe membrană bistratificată lipidelor pare să depindă de raza de curbură. Prin urmare, celulele bacteriene mici absorb în mod eficient ADN la o tensiune semnificativ mai mare (10 kV / cm sau mai mult) decât celulele mari de animale și plante, care absoarbe în mod eficient ADN la o intensitate a câmpului de 1-2 kV / cm.
Electroporarea - metoda cea mai simplă, eficientă și reproductibilă pentru introducerea ADN în celule. Cu toate acestea, până de curând, această metodă a fost utilizată într-un număr limitat de laboratoare în absența dispozitivelor seriale - electroporator. Apariția și îmbunătățirea acestor dispozitive în următorii ani va duce la utilizarea pe scară largă a acestei abordări în ingineria genetică a unei game largi de tipuri de celule.
Fig. 46. Metoda electroporație
„Mini-celule“ preparate prin blocarea celulelor donatoare mitoza colcemid. Pentru celulele de prelucrare a colcemid continue în care fiecare cromozom este format în jurul unei noi membrane nucleare. Prelucrarea cytochalasin B și rezultatele de centrifugare în formarea de celule mici, reprezentând microkernel încapsulate în membrana citoplasmatică.
Rezultante mini-celulele sunt foarte sensibile la tot felul de influente, astfel încât să fuzioneze selectate condiții specific moale. Metoda dificilă, toane, eficiență scăzută - 10 -6 - 10 -7.
Ambalare în lipozomi utilizate pentru protecția materialului genetic exogen de acțiunea distructivă a enzimelor de restricție.
Lipozomii - cochilie sferică formată din fosfolipide. Preparat prin agitare soluția lor ascuțite amestecul apos și fosfolipide lipidice sau sonicarea emulsie apoasă. Lipozomii constând din fosfatidilserina și colesterol sunt cele mai potrivite pentru introducerea ADN în celule de plante și de animale. Sistemul de transfer prin lipozomi sunt mici toxice pentru celule.
Metoda balisticii biologice (Biolistics) este una dintre cele mai eficiente metode pentru data de transformare a plantelor, în special monocotiledonate.
Metoda constă în faptul că cele mai mici particule de tungsten, cu un diametru de 0,6-1,2 microni, pulverizat vector ADN conținând constructul de genă dorită pentru transformare. Particulele de tungsten care transportă ADN, se aplică pe substratul de celofan și plasate în interiorul pistolului biolistică. Calus sau de suspensie de celule este pus într-un vas Petri cu agar mediu și plasat sub arma biobalistic la o distanță de 10-15 cm. Pompă de vid Gun reduce presiunea la 0,1 atm. Timpul de depresurizare particulelor de tungsten sunt ejectate cu viteză mare dintr-o armă balistică și rupere peretii celulelor sunt incluse în citoplasmă și nucleul celulelor.
De obicei, celulele, care sunt amplasate direct pe centrul matriței datorită cantității și presiunii particulelor de tungsten pur, în timp ce în zona de 0.6-1 cm de la centru sunt mai convenabil celule protransformirovannye. Celulele au fost apoi transferate cu grijă pe un mediu de cultură și regenerare ulterioară.
Cu arma biobalistic era monocotiledonate protransformirovany, cum ar fi porumb, orez, grâu, orz. Astfel sa obtinut transformante stabile ale plantei. Progrese suplimentare în obținerea monocotiledonate transgenice, biolistică este utilizat pentru transferul direct al ADN în polen embriogen și mai departe dihaploide rapid obtinerea plantelor transgenice, care sunt pas important în reproducere. În prezent, această metodă a fost realizată, și transformarea plantelor de tutun după regenerarea plantelor haploide obținute transformante stabile.
Alte capitole din această secțiune: