Producerea preparatelor histologice includ: 1) materialul de fixare; 2) microtomie; 3) colorarea secțiunilor.
Material de fixare
Informații generale. fixare REZUMAT este luată pentru a menține bucățile de organe și țesuturi de putrefacție și procese care afectează structura țesuturilor de fermentație.
Înregistrate de un număr de țesuturi suferi modificări fizice și chimice. Cele mai importante dintre acestea sunt: coagularea rapidă a proteinelor și a lipidelor în parte și tranziția lor de la o stare în care materialul nu este schimbat de stocare pe termen lung și în timpul tratamentelor ulterioare.
fixare tisulară se efectuează în lichide cu o compoziție diferită. Cel mai folosit sunt formol, un alcool, cel puțin acetonă, clorură mercurică, și altele.
Fixație cu formol. formalină venală (soluție apoasă 40% de formaldehidă) este utilizat în 10%, 15% soluție (10.0-15.0 formol corupt la 90,0-85,0 apă). concentrația de formol a spus relativ rapidă (48- 72 h) impregnează materialul și fixează bine. Este imposibil să se stabilească materialul într-o soluție de concentrație mai mare de formol sau formol în vandabile nediluat. In acest caz, straturile superficiale ale țesăturii sunt compactate rapid formează o crustă care împiedică pătrunderea adâncimii lichidului de fixare, în care procesele de autoliză poate continua.
Datorită faptului că în formol conține întotdeauna o anumită cantitate de acid formic, care poate afecta negativ țesutului și interfera cu anumite metode de prelucrare ulterioară a materialului (argint, etc.), trebuie să se neutralizează cu cretă. S-a adăugat 100 g de formol disponibil comercial (soluție de formaldehidă 40%) de cretă de Sud. Conținut agitat în mod repetat, și apoi se lasă să stea până la creta se sedimentează în partea de jos de feluri de mâncare. De asemenea, trebuie amintit că, în timpul depozitării formalină într-o cameră rece formaldehidă .polimerizatsii capabil și pierderea lichior bogat in forma de precipitate albe. Pentru a preveni acest formol recomanda stocarea într-o cameră caldă, într-un recipient închis.
Bucăți de țesut prelevate pentru examinarea histologică nu ar trebui să fie mai mare de 0,5-0,7 cm. Pentru bucăți de pânză nu se fixează strâns pe pereții băncilor, au pus vată sau hârtie de filtru. Volumul fluidului fixator trebuie să depășească aproximativ 10 ori volumul materialului luat. formol apos Fixation nedorit în cazurile în care tesutul are obiectivul studiului detectarea substanțelor solubile în apă.
In cazurile in care un studiu rapid, bucăți de țesut au fost fixate în formalină, încălzit la 85-90 ° C. Durata fixării pieselor de grosime de 2-3 mm, la o temperatură de 10-15min. Pentru materialul de stocare prelungită; în formol țesut fixație format nămol brun închis, care contaminează preparatele. Eliminarea precipitațiilor este recomandat secțiunilor histologice mai mici de 2-3% soluție de peroxid de hidrogen sau o soluție de hidroxid de potasiu de concentrație 1% și apoi se spală de câteva ori cu apă.
Fixație cu alcool. Această metodă este adecvată numai în cazurile krgda trebuie fixate în substanța de țesut, solubil în apă și soluții apoase de cleme. Pentru fixarea alcoolului utilizat 95 sau 100 °. Alcoolul, îndepărtarea apei din bucățile de țesut și se diluează este mai puțin puternic. Prin urmare, se recomandă să se schimbe alcoolul de mai multe ori. Bucăți de alcool fixare tesut trebuie sa fie de 2-3 mm grosime. În timpul iernii, se recomandă să se utilizeze formol-alcool (alcool 70 ° -90,0, formol 10,0).
microtomie
Informații generale. Pentru fabricarea secțiunilor de țesut fixe necesită garnitură suplimentară. Există mai multe metode: congelare, țesut de înmuiere celloidin ei, parafină, etc ...
După fixarea și etanșarea țesutului, sau altfel preparate secțiuni. pentru subțire
Felii de grosime egală se potrivesc pentru studiul macroscopic bucura microtomului speciale aparate. Ele există mai multe tipuri. Cele mai frecvente sunt Microtoame sanie și congelare (Fig. 137). Principiul dispozitivului constă în faptul că, după fiecare masă tăiate, la care este atașat țesutul se ridică la o înălțime predeterminată. Astfel, se obțin felii de grosime egală. Tăietura trebuie să fie suficient de subțire și transparentă, se face, de obicei, felii groase la 4 la 15 m> km. Congelarea țesuturilor. La fabricarea preparatelor histologica tisulare congelate într-un microtom de congelare, aplicand dioxid de carbon lichid, eter, cloretilen sau folosind un curent electric pe masa de semiconductori.
Prin congelare tesut este suficient de rapid pentru a face preparate histologice posibile. Această metodă este utilizată și în studiile de tesut pentru depunerea de grăsime și substanțe cu conținut de grăsime ca grăsimi sunt solubile în alcooli, acetonă și xilen.
Turnând celloidin tesut. Pentru a umple de droguri în celloidin extirpate secțiuni de țesut de 1-3 mm grosime și consistent purtată prin alcooli de creștere a Cetății - 50, 75, 95 și 100 °, înmuiere timp de 24 h fiecare. După tăria alcoolică a bucățile de material 100 ° recomandat de două ori înmuiere timp de 24 de ore de fiecare dată. Apoi, bucățile de material sunt transferate într-un amestec de părți egale de absolut (100 °) și eter de alcool, de asemenea, timp de 24 h. După aceea, piesele de țesut au fost plasate în primele 2%, apoi 8% soluție celloidin timp de 2-3 zile fiecare.
Celloidin preparat din film - sau filme. Inițial, aceasta este spălată de gelatină în apă fierbinte, apoi uscat, tăiat fin și se dizolvă într-un amestec de părți egale de alcool și eter. O soluție 2% consistență celloidin similar cu colodiu lichid, iar 8% seamănă cu un sirop gros. După expunerea celloidin în bucăți groase de țesut cu aceeași celloidin turnat într-o cupă sub capota, unde este comprimat pentru 12-24 ore. Când celloidin densitate de cauciuc elastic dobândi, blocurile sunt tăiate și lipite pe celloidin lor blocuri de lemn pătrate. Acesta poate fi umplut cu bucăți de pânză celloidin direct pe zar. ILIB marcate, pentru care una dintre suprafețele laterale ale cubului face cu cerneală de desemnare corespunzătoare. De obicei, scrie camera de studiu.
Magazin de piese încărcate în celloidin, un alcool de 70 °. Umpleți țesutul în parafină. Deshidratarea țesutului este realizată în alcooli de creștere a tăriei, în același mod ca și în cazul; cabluri tselloidinovoy. După expunerea pieselor tisulare la 100 ° alcool care sunt transferate într-un amestec de părți egale de alcool absolut și xilen timp de 2-3 ore, apoi se toarnă bucăți de țesut curat de xilen și menținut timp de 2 -. 3 ore După acest timp în care sunt transferate într-un nou xilen curat. . timp de 2-3 ore și apoi în parafină-xilen (soluție saturată de parafină în xilen la 30 ° C) timp de 1 până la 1,5 ore apoi bucăți de țesut au fost plasate într-o plasă; parafină la temperatura 54- 56 ° C timp de 1,5-2 ore. Apoi au fost înglobate în parafină în hârtie sau metal mucegaiuri și răcite în apă. bucăți compactate pânză, precum și tselloidinovye blocuri lipite sub formă de cuburi de lemn și de marcare.
colorarea secțiunilor
Informații generale. Colorarea secțiuni histologice bazate pe elemente de țesut de afinitate inegale la anumiți coloranți. Nucleele celulare au fost colorate cu un miez capabil, și citoplasmă - culorile acide. Prin urmare, distincția principală sau nucleară, și vopsea acide sau difuze.
Cel mai adesea în practica veterinară normală aplicată secțiunilor de colorare mortem cu hematoxilină-eozină potrivit Van Gieson, Perls, Sudan III și altele.
Hematoxilina-eozină. secțiuni colorate în vase Petri mici sau pahare. Această metodă este folosită pentru vopsirea secțiunilor preparate prin orice metodă. In aceasta celula nuclee dobândi un albastru-violet sau albastru închis și citoplasmă și substanța fibroasa - albastru sau roz-roșu deschis. Grăsimi și lipide nu sunt vopsite. Hematiile de mamifere, deoarece acestea nu conțin nuclee sunt colorate doar cu eozină.
felii colorate în vase Petri produs după cum urmează.
1. felie de ac de disecție se transferă din apă în soluție timp de 2-5 min hematoxilina.
2. Se clătește în apă, 2-5 min.
3. Cufundați pentru 10-20 s în soluție de acid clorhidric 1% la 70 ° alcool (în cazul feliei este puternic hematoxilina repictata, trebuie păstrate în această soluție este ceva mai lungă).
4. Se spală în apă pură timp de 5-10 minute.
5. Se spală ușor în soluție alcalină (într-un borcan de apă, se adaugă 1-2 picături de amoniac lichid) timp de 10 minute.
6. Se spală din nou cu apă curată timp de 10 până la 15 min. Dacă tăietura după apă alcalină spălat suficient, el interogat slab eozină.
7. Stain cu eozină timp de 3-5 min.
8. Se clătește în apă timp de 1-2 min. 280
9. deshidratate în alcooli de creștere kreposti- 75, 90, 100 °. În cazul în care reducerea repictate eozină, ar trebui să fie un pic mai mult pentru a păstra în 75 ° alcool.
10. antireflectant karbolksilole.
11. Cu ajutorul unei spatule și se taie acul este transferat într-un diapozitiv de sticlă.
12. Se usucă hârtia de filtru.
13. La secțiunea picătură se aplică sau balsamic canadian de brad si acoperite cu o lamelă de acoperire.
Pictura lui Van Gieson. În secțiunile colorate cu Van Gieson, țesut conjunctiv este vopsit în roșu aprins, restul materialului - galben sau gri-galben. Nucleele sunt colorate în negru sau violet închis.
Colorație produs după cum urmează.
1. Secțiunile au fost intens colorate cu hematoxilina (Hematoxilină mai bine Weigert) și clătite cu apă.
2. Imediat picrofucsin transferat în 3-5 minute (amestec de soluție apoasă saturată de acid picric și 150.0 soluție apoasă saturată de fucsin - 3,0-5,0).
3. spălat rapid în apă (extracte de apă de cutoff magenta).
4. deshidratată alcool 95 ° timp de 1-2 minute.
5. înălbire în karbolksilole și încorporate în ulei de brad ca atunci când se colorează cu hematoxilină și eozină.
Acoperirea din Sudan III. Sudan III - neutru azokraska solubil în alcool, acetonă și grăsimi nu sunt solubile în apă. Colorarea Sudan III produs pentru determinarea secțiunilor de grăsimi și lipide. Echipament de vopsire urmează.
1. Secțiunile congelate plagued transferate la 0,5 1 min la 50 ° alcool.
2. Secțiunile au fost plasate în soluție svezhefiltrovanny Sudan timp de 10-20 min.
3. clătite cu alcool 50 ° timp de 0,5-1 min.
4. se spală cu atenție cu apă timp de 10 - 15 min.
5. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină alaun Ehrlich sau Boehmer.
6. Se spală cu apă timp de 3-5 minute. Revopsite în felii diferenția hematoxilină
Soluția apoasă 1% de acid clorhidric, se spală cu apă alcalină și apoi cu apă pură.
7. constând în glicerol sau glicerol-gelatină.
8. Se acoperă geamul de acoperire. Colorare Perls. Această metodă de colorare este utilizat pentru a identifica hemosiderina tesut.
1. Din apă distilată transferat ace de sticlă secționate timp de 15-20 minute într-un amestec proaspăt preparat constând dintr-o parte soluție de 2% din ferocianura și o jumătate de părți de acid clorhidric apos 1%.
2. Se spală cu apă distilată timp de 5-10 minute.
3. Dokrashivayut alaun carmin 15-20 de minute.
4. Se clătește în apă și se trece prin alcooli karbolksilol și balsamul.
Iron contin pigment - hemosiderina - capătă o culoare albastru-verzuie sau albăstruie.
Colorare Turevichu. Prin intermediul Turevicha secțiuni colorate au fost făcute din creier pentru diagnosticul de rabie. În acest caz, Universitatea Babeș gambă - Negri și celulele roșii din sânge sunt colorate, celulele nervoase hematoxilină rosii magenta - în albastru.
Pentru studiile histologice care iau felii de hipocampus și cerebel lor fixate în formol 10%, acetonă sau Adutskevich lichid următoarea compoziție: acid acetic 80% - 1 parte de cloroform -2 părți etil alcool 96 ° - părți b.
Durata fixării la temperatura camerei timp de 1 zi în formol, acetonă și Adutskevich lichid -. După 3-6 ore de fixare bucăți tăiate nu mai mult de 1 până la 1,5 mm, încorporate în parafină și apoi prepara secțiuni histologice, uscate și colorate.
Coloration Turevichu urmează.
1. Secțiunile înainte de vopsire deparafiniruyut Xilen 10-20 min.
2. Se spală cu alcool.
3. Se colorează celulele cu hematoxilină nucleu Wei-Gert timp de 2 min.
4. Secțiunile au fost clătite cu apă.
5. Opțional pătate 1% - o soluție salină
Acid fucsin timp de 1 min.
6. Se spală cu apă.
7. Diferentiaza într-un alcool de 95 ° și o soluție apoasă saturată de acid picric timp de 10-20 secunde pentru a șterge nuanță galbenă.
8. hârtie de filtru uscată.
9. deshidratat cu alcool absolut.
10. Antireflective în xilen timp de 1 minut.
11. Concluzionăm în Canada sau brad, balsamurilor.
Fig. 137. Vedere generală a microtom de înghețare:
/ - furtun de dioxid de carbon;