la munca de laborator în microbiologie
pentru studenții farmaceutice și universitare
Editat de Doctor in Stiinte Medicale, profesor universitar, academician al Ucrainei Antonov I.L.Dikogo
SECȚIUNEA „Morfologia Microorganisme“
Subiect: Tipuri de microscopie: scopul și principiile de aplicare
Scop: Familiarizarea cu principiile și metodele de studiere a microorganismelor morfologiei.
Microorganismele poate fi văzut atunci când se utilizează un optic-bor - microscop. Microscop (de la milionimi greacă -. Mici și scopeo - ceas) este folosit pentru a studia obiecte mici,-Mykh invizibile cu ochiul liber. În microbiologie microscop este folosit pentru a studia atat microbi moarte de viață și, sau sub formă colorată. În practica microbiologică, în funcție de scopul obiectivelor de cercetare, folosind diferite tipuri de microscoape: svetopolnuyu, contrast de fază, anoptralnuyu, luminescente, e.
Întrebări pentru auto
1. Tipuri de Microscopie: svetopolnaya, întunecat, contrast de fază, anoptralnaya, luminiscență-procentuale, e.
2. svetopolnogo Microscopul dispozitiv și regulile pentru lucrul cu ei. Creșterea sistemului de imersiune.
2. N.P.Elinov, N.A.Zaikina, I.P.Sokolova. Manual de utilizare dstvo pentru munca de laborator in microbiologie. - M. Medicine, 1988. - S. 9-35.
Manipularea dispozitivului svetopolnogo microscop iporyadok
svetopolnaya uzuale (sau lumina) microscopie este utilizat pentru a studia preparatele microscopice colorați care absorb rapid lumină.
Fig. 1 prezintă svetopolny microscop biologic. Partea sa mecanică cuprinde o bază (sau trepied) cutii micromechanisms, masa de obiect, tuburi și titularul, binoculară, o turelă lentilă.
Trepiedul distinge porțiunea inferioară (sau picior) și o parte superioară (sau coloana). Pentru a coloanei, care servește ca un mâner pentru transportul unui microscop atașat o treaptă mobilă,-Koto ing obiect în studiu este plasat. El are o centrare și cu șuruburile se mută de droguri în două direcții reciproc perpendiculare. deplasare Countdown în ambele direcții pot fi realizate prin cântare vernier și până la 0,1 mm.
La partea superioară a coloanei se alătură țeavă microscop - tub. Tubul este un telefon mobil, care este atașat la obiectivul, care servește pentru a mări obiectul de testare. Tubul este acționat în sus și în jos cu două sisteme de șuruburi: makrovintom și microscrews pentru focalizare fină.
Pentru o reperare dur servește rackwheel sau rack, cu un șurub makrometricheskim mișcare conducta. Acest șurub este utilizat pentru mărire când scăzută, precum și o mărire de mare pentru instalarea inițială dur. Mutarea makrovinta mâner talon posibil în termen de 50 mm.
Pentru o setare mai exactă servește ca un șurub micrometric. Pe brațul drept tamburul de focalizare fină fixată cu o scală divizată în 50 părți. Prețul pe scară diviziune tambur 0,002 mm. O rotație a tamburului corespunde cu deplasarea tubului de 0,1 mm. Cantitatea totală de mișcare a granulei de blocare pentru a bloca este egală cu 2,2-2,4 mm. micrometru cu șurub este una dintre cele mai fragile ale microscopului, și de manipulare necesită o îngrijire specială.
Moving-bilelor, folosind cele două șuruburi, este setat astfel încât să se obțină cea mai clară imagine a microscopice; Acest lucru se realizează atunci când distanța obiectului de la obiectiv egală cu lungimea focală a obiectivului.
Partea superioară a capului de o parte se termină tubusoderzhatelya care servește pentru fixarea și revolver baril. Partea superioară a tubului se află un ocular, iar partea de jos a revolverului său fix, în care priza de insurubare-lentile sunt. Revolverul este rotit în jurul axei sale, care vă permite de a pune unul sau un alt obiectiv, dacă se dorește, în luchit creștere mai mare sau mai mică.
Partea optică constă dintr-o lentilă microscop, iar ochiul dispozitivului lyara iluminat.
Dispozitivul de iluminat se află în faza de probă și constă dintr-o oglindă și un condensator cu o diafragmă. Oglinda servește pentru a reflecta razele de lumină spre obiecte tivu și prin aceasta în microscop. O parte este oglinda plat, cealaltă concav. oglindă plană utilizate în lumina lumina zilei împrăștiate, și concav - situații-os de lumină artificială.
Condensatorul este o lentilă lenticular aplicată pe partea de jos a scenei, astfel încât lentila condensatorului se află sub deschiderea etapei. Condensatorul servește pentru colectarea (condensarea) a fasciculului de raze de lumină, care oferă cea mai mare acoperire a obiectului testat.
Atunci când condensatorul microscop cu lumină naturală, opțional, du-te pentru a ridica nivelul scenei; atunci când condensator artificia Venn-lumină este coborâtă, atâta timp cât la ma-resturi de creștere a imaginii sursă de lumină nu apare în planul de droguri. Atunci când microscopia preparate necolorate condensator ar trebui să fie, de asemenea, eliminate.
Între oglinda și diafragma condensator este plasat, Koto-paradis controlează cantitatea de raze incidente pe obiectiv. Se compune din petale de oțel și printr-o pârghie poate schimba diametrul său. medicamente pictate VASTE ar trebui să fie luate în considerare cu o deschidere deschisă; în studiul preparatelor necolorate au nevoie pentru a deschide diafragma.
Lentile sunt sistem de lentile biconvexă este închisă într-un metal op-Rav. Anterior (fata) al lentilei este producătoare principal de mărire. In spatele lentilelor ei corectarea POZĂ-set și așa-numitele corective.
Gradul de creștere depinde de obiectul în studiu Cree-curbură lentilă folosită. Este mai mică curbura a lentilei, este mai mic creșterea, și invers, cu atât mai mare curbura a lentilei, cu atât mai mare de mărire. De obicei, microscop tivy-site-uri sunt lungimea Desemnarea distanța focală numerică care depinde de curbura cristalinului: suprafața mai convexă a lentilei, este mai mică distanța focală și cu atât mai mare a primit-set O creștere.
caracteristica lentile constă din propria creștere, distanța focală, apertură numerică. Este mai mică distanță focală, cu atât mai puternică a cristalinului, mai mult decât propriul său câștig. Inscripționat de pe cilindrul obiectivului de creștere proprii ( "8, '20, '40, '90) și deschiderea numerică. deschidere numerică - produsul de lung indicele de refracție al mediului prin sinusul unghiului de jumătate gaura - lentile descrie unghiul la care poate încă OMM-DIT în lentilă calea înclinat. Pe lângă aceste denumiri de pe carcasă de lentile apochromatic scris „apohr“ și imersiune-onnyh „RI“ sau „MI“ - lentile de imersie (ulei) sau „VI“ - imersiune apă Nye.
Lentile de vin în două sisteme: achromats și apo. Acromatic sunt mai simple, dar au o serie de dezavantaje, care sunt abordate în lentile apochromatic mai complexe. În aplicarea lentile de Apocromat atins imaginea borcan-Ness și elimină aberațiile cromatice. Acesta din urmă este deosebit de important pentru obiecte colorate microscopie. Toate lentilele (achromats și apo) sunt împărțite în mersionnye uscat și im. Dacă între obiectivul și este considerat prin prep-volum este aer, o astfel de lentilă este numit uscat. Dacă obiectivul este scufundat în lichid, care umple spațiul dintre obiectiv și partea din față preparării sale, o astfel de lentilă se numește imersat sau imersie (immersio - dip). In-anchetă SRI microbii imersiune utilizate exclusiv sau în gruzhnaya, sistemul de lentile.
Lentilele de imersie au un avantaj față de uscat. Cale comparativă a razelor luminoase în sisteme uscate și imersiune este prezentată în Fig. 2. Atunci când microscopia cu ajutorul unei raze de lumină uscată sistem de du-te-ing din oglindă prin lentila condensatorului să treacă prin mediul neomogen, indicii de refracție diferite. Astfel, aerul (indicele de refracție 1,0), fasciculul de raze de lumină intră în sticlă (indicele de refracție 1,5), și apoi din nou în aer și în cele din urmă în obiectiv frontal. La fiecare dintre aceste tranziții o parte din razele sunt refractate la interfața de fluide diferite este deviat în lateral și nu dă nici pop-lentilă. Ca urmare, câmpul vizual este iluminat nedos-tatochno, care este deosebit de important atunci când se utilizează o sisteme de mărire puternică Mami, în cazul în care o lentilă frontală foarte mică. Pentru a evita acest lucru, obiectivul este cufundat într-o picătură de lichid (ulei de imersie, apa), un indice de refracție apropiat de sticla refractie-ence lung. Cea de a doua picătură de același lichid la uzură pe condensator. Astfel, condensatorul, lentila lichid lichid pre-Paratov și reprezintă un singur subiect ASIC fără a provoca devierea fasciculului de lumină.
Ocularului (de la cuvântul latin oculus - ochi) este format din două lentile convexe (-plano pick-fierbere și oculare). Aceasta crește imaginea obținută prin lentila, în 7, 10 sau 15 de ori. Astfel de ocularele simple, folosit de obicei cu lentile acromatice. Atunci când se lucrează cu apo necesitatea de a utiliza o, așa-numita compensație specială, ocularele. Acestea sunt selectate într-o astfel de lentilă Obra zoom, ele dau eroarea cromatică inversă apo cromatism reziduală și pentru că compensează. Trebuie avut în vedere faptul că doar crește lentila de obiect, un ocular, de asemenea, nu crește studiat subiectul, dar numai tensiunea Mod imagine obținută în obiectiv.
Mărirea totală a microscopului este egală cu produsul dintre creșterea a cristalinului ocular pentru a crește. De exemplu, combinația dintre obiectivul de imersie 90, cu un ocular 10 oferă o creștere a obiectului de 900 de ori.
Calitatea microscopului nu depinde numai de creșterea IC obiect Urmat, ci este determinată de puterea de rezoluție. Prin aceasta din urmă trebuie să se înțeleagă faptul că distanța cea mai scurtă mi-forward două puncte de droguri, care poate fi de imagine chetlivo pentru a distinge sub microscop. Este mai mică distanță-set, cu atât mai mare puterea de rezoluție.
Puterea de rezoluție a microscopului cu imersie sistem biologic clorhidric este de 0,2 microni. Prin urmare, atunci când se utilizează o singură Kim obiecte de microscop sunt în raza de vizibilitate nu mai puțin de 0,2 microni.
Trebuie amintit faptul că obiectivul de imersie necesită o manipulare atentă în special. Omiteți această nevoie de lentile viespile CAU TI nu pentru a zdrobi sticla de droguri, ceea ce atrage după sine daune la partea din față a cristalinului. Scufundați imersiune site-uri-TIV într-o picătură de ulei pe diapozitiv ar trebui să fie sub controlul ochilor uitam din lateral, cu ochiul trebuie să fie la nivelul scenei. După cufundarea obiectivul în ulei-ka PLU, în căutarea prin ocular, folosind șuruburi makrometricheskogo tub cu atenție mai mic microscop, până când vă aflați într-un câmp de vedere al conturului medicamentului. Apoi, cu ajutorul unui șurub de micro-metrice set imagine obiectului curent.
La capătul tubului de ridicare microscopie de micro-Osprey, și apoi îndepărtați de droguri; o lentilă frontală a șters ușor cu o cârpă moale, uneori umezire cu alcool, de referință timp apă 1: 1.
De iluminat. Atunci când se lucrează cu un condensator Abbe independent de sursa de lumină trebuie doar să pol-Call oglindă plat.
dispozitiv de iluminare (sau iluminarea aparatului lui Abbe) Acest constituie o oglindă, un iris-diafragmă și condensator. Zer-calorii, pentru că rama este montat în furca spe-cial se poate roti în două direcții perpendiculare reciproc-TION. Una dintre suprafețele reflectorizante ale oglinzii este plat, celălalt concav.
diafragmă iris modernă prin tăiere de tip elev, poate regla magnitudinea fasciculului de lumină care intră în condensator-prezent. Acest lucru este important, deoarece raportul de deschidere (deschidere) al condensatorului trebuie să fie întotdeauna ușor mai mică decât cea a obiectelor-TIVE.
Condensatorul este un sistem de lentile, montat într-un cadru metalic conic-TION. Cu cât obiectivul, cu atât mai mare deschiderea a condensatorului. Pentru i-mapping distincte impune ca medicamentul a fost în centrul de con densora. În acest scop, condensatorul este deplasat în direcția verticală, în termen de 20 mm.
Raze muta. Fasciculul de lumină reflectată de oglinda, prin dia-Phragmen intră în condensator. Refractate în lentilele sale, razele cad pe medicamentul sub forma unui con, vârful care Obra-Schena la medicament. După trecerea prin droguri dyatsya raze de re-DEBIT sub forma unui con și se încadrează în obiectiv. Refractate în obiectiv, razele de ieșire din ea da naștere, dar imaginea inversă. Această imagine este construit grinzi la o distanță față de partea din spate a lentilei obiectivului, la deschiderea ocularului, T. E. În planul final de lentile oftalmice. Dintre razele oculare trec în ochi, și are loc presupusa retina, îmbunătățită, imaginea inversă. Astfel, la timp, obiectivul crește subiectul în cauză, și ochiul de LNR-zoom-uri. În consecință, capacitatea de micro-ROSCOP este de a crește cantitatea de mărire furnizată de lentila și ocular. Cele mai multe lentile oferă cea mai bună imagine tub cu o lungime de 160 mm și ocularele sunt de obicei proiectate pentru distanță de 250 mm, ceea ce corespunde cu ochiul liber normală la distanță-Niju de text care poate fi citit.
Mărirea totală a microscopului (V) poate fi determinată în vedere aceste date în conformitate cu formula:
în cazul în care Fob - lungimea focală a obiectivului;
Fok - lungimea focala a ocularului.
O iluminare bună se realizează prin setarea luminii pe Me-Todd Keller. Pentru acest iluminator este setat la distanță SRI 30-40 cm de la microscop și se deplasează cartușul cu un bec sau întreg iluminatorul obține o imagine clară asupra fecale cu filament-lampă deschidere închisă complet al condensatorului astfel încât să umple complet condensatorul de imagine gaura. Închiderea deschiderea ledurilor, deschideți diafragma con densora și se deplasează condensator atinge ascuțite POZĂ-TION deschidere iluminator sub microscop. Cu o imagine în oglindă a deschiderii este fixată la centrul terenului de vedere, și este deschis diafragma iluminator, astfel încât acesta este tot un vescheno câmp vizual aparent. Dezvăluie mai mult diafragma nu este necesară, deoarece nu sporește iluminarea, și numai contrastul capacitatea de ecluza din cauza luminii ambientale.
Reguli generale pentru lucrul cu microscopul. Microscop modern - un instrument optic care necesită respectarea strictă a unui set de reguli atunci când se lucrează cu el. Acestea se referă la tratamentul instrumentului și de îngrijire pentru ea, și să aplice iluminare corespunzătoare, selectarea în fiecare caz, cel mai bun exemplu de realizare a sistemului optic (ocular - Ob-injective - condensator), etc ...
Pentru a proteja împotriva prafului microscopul trebuie depozitat sub acoperire. Din când în când suflare urmează verifica curățenia și starea optică și ștergeți-l, dar numai din exterior. Pentru curatarea optica a folosit o perie de păr sau o cârpă moale, îmbibat cu alcool etilic, diluat cu apă (1: 1), dar în orice caz, nu se aplică în benzen sau xilen pentru a se evita lentile lipire. piese glisante mecanice se șterge cu xilen sau benzil-SG, și apoi uns.
Mișcarea bacteriilor și spirochete pot fi observate în câmpul întunecat, care diferă de lumină-bom preparat convențional de iluminat od. În acest caz, utilizați o lumină laterală, prin care se obține o imagine, Gosia obiect luminos pe un fundal întunecat. Principiul câmpului întunecat se bazează pe faptul că razele de lumină sunt deviate particulele dense care se încadrează într-o parte (cum ar fi microbi) și ultimul prin acest ochi al observatorului sunt reprezentate de luminoase. Bo iluminat kovoe la microscop poate fi obținut prin înlocuirea, iluminator convențional condensator special cu umbrire în centru. O astfel de condensator ține toate razele de lumină centrală și trece doar periferic (Fig.3). In schimb, un condensator așternut special pentru câmp întunecat poate utiliza convențional iluminant-lem, între cele două lentile este inserat în cerc negru Bu magi diametru ceva mai mic decât obiectivul. Trebuie să lucrăm cu o sursă de lumină puternică (lampă cu arc sau lampoch normale Coy 200-300 lumânări). Echipamentul de cercetare este după cum urmează. Aplicat pe o lamelă de sticlă și o picătură de material este atent acoperit cu un capac de sticlă, pentru a evita bule de gaz-ing. Apoi, suprafața a fost plasată o picătură de ulei de apă din condensator sau pin, iar glisiera cu preparatul este introdus pe picătură.
Medicamentul este considerată fie printr-un sistem uscat puternic (lentilă '40), sau printr-un sistem de scufundare. În acest din urmă caz, geamul de acoperire este aplicat ca o picătură de ulei de cedru, și la un manson imersiune mic înșurubată - dia-phragma pentru a reduce lentila diametrului lumenului.
Atunci când această metodă de fascicule luminoase de microscopie un obiect, nu intra in lentila microscopului, câmpul vizual rămâne întunecat și obiectul în contextul său pare iluminat (fig. 4). efect darkfield este creat folosind un condensator special (paraboloid sau cardioid) sau un condensator convențional cu un cerc ascuns de partea centrală hârtie neagră.
Pentru observarea într-un set de lumină câmp întunecat și preț-Trier atât câmp luminos și înlocuirea condensatorului-spe cial, se adaugă ușor la maxim, dezvelirea eșecului dia-Phragmen inclusiv reostate și iluminator.
Formulările pentru cercetarea în domeniul întunecat ar trebui să fie fierte la o coverslips foarte curat și supus anumită grosime: subiect - nu mai mult de 1,2 mm, cu acoperire VASTE - 0,17 mm. Se prepară tipul de drog „zdrobit“ sau „agățat“ picături (Fig. 5). Între preparare și condensator a fost introdus ulei de imersie (picătură este aplicat lentila superioară a condensatorului). Apoi, ridicarea și coborârea condensatorului atinge aspectul câmpului de vedere al locului de lumină, care utilizează un control de suspensie speciale șuruburi de ieșire rovochnyh condensatorului în mijlocul câmpului vizual. Apoi, utilizați muta dreptul de a crește de supraveghere.