Lapte de droguri-coagulare, pe lângă activitatea de coagulare a laptelui, și posedă activitate proteolitică, adică capacitatea de a scinda proteinele din lapte.
Din cauza lipsei acute în chimozină naturale industria brânzeturilor (cheagului) sunt în creștere găsirea substitute de aplicare microbiană și origine animală. Cu toate acestea, nu toate produsele pot înlocui cu succes cheag. Formulările având activitate proteolitică ridicată, provoacă hidroliza profundă a cazeinei, ceea ce duce la o reducere drastică a calității brânzei (apariția amărăciune). În acest sens, atunci când se stabilește caracterul adecvat al unui medicament ca un substitut pentru cheagului necesare pentru a investiga activitatea proteolitică.
O caracteristică a acțiunii respectivului medicament pe molecula de cazeină este atacul selectiv al Telecomunicațiilor fenilalanil-metionină la cazeină, care, la rândul său, duce la descoperirea de acid fosforic rezidual și combinații parakazeina molecule în formarea cheagurilor de Ca-poduri. Schematic aceasta poate fi exprimată după cum urmează (Figura 7):
moleculă substanțial nu hidrolizat de cazeină, care oferă o rezistență ciorchine și mai departe că boabele de brânză. Grăitor, acest lucru este prezentat în Figura 8.
În acest caz, creșterea curbei în 15 minute (curba 1) arată formarea GMP. Hidroliza Ulterior este practic absentă. Abaterea de la aceasta (curba 2) conduce de obicei la perturbări în formarea cheagurilor și maturarea brânzei. O distanță între curbele 1 și 2 se numește o măsură de proteoliză nespecifice (ISP). Cu cât această valoare, cu atât mai mare riscul de arome amare, necurate și alte în produsul finit.
Figura 7 - Schema de acțiune a cheagului pe molecula de cazeină
Figura 8 - graficul formării timpului de reacție produși de hidroliză caseina
În această lucrare, sarcina testului pentru a determina adecvarea preparatului ca substitut pornind de la o intensitate de hidroliză cazeină cheag în timp.
Principiul metodei. Determinarea cheagului și substituenții săi de origine microbiană și animală bazate pe produsele de hidroliză caseină acumulate sunt solubile în acid 1,125 M tricloracetic la un anumit interval de timp de la începutul reacției.
Progresul. Fiolele au fost luate de 2 ml de substrat cazeină preparat și incubat timp de 5 min. la 35 ° C. Apoi pipeteaza 0,5 ml de preparat enzimatic cu înregistrarea timpului simultan. Reacția a fost stopată după 5, 10, 15, 20, 30, 40, 90 de minute prin adăugarea a 5 ml de soluție 1,125 M TCA. Amestecul rezultat a fost agitat și lăsat să stea timp de 30 minute, după care a fost filtrat printr-un filtru dublu pliat. În paralel cu această definiție sunt stabilite proba zero și unică.
La zero, într-o eprubetă se iau 2 ml dintr-o soluție de substrat, 5 ml de soluție 1,125 M și 0,5 ml TCA soluție preparatul enzimatic.
Rezultatul necompletate reactivilor extincție se opun. În acest scop, 5 ml 1,125 M soluție TCA se adaugă 2,5 ml de apă distilată și filtrată în același mod ca și în cazul experienței zero după 30 de minute. Filtratul se determină produșii de hidroliză cazeină sunt solubile în soluție TCA 0,75 M. O anumită cantitate de filtrat (maxim 1 ml) au fost luate în eprubete în așa fel încât concentrația de produșii de descompunere ai cazeinei obținute în colorimetrie este cuprinsă în intervalul la 20 la 150, se neutralizează cu o cantitate egală de soluție 0,75 M de NaOH (pentru a furniza pH-ul dorit pentru reacția cu reactanți de cupru și fenolici) se adaugă apă distilată până la un volum de 2 ml și apoi toți reactivii necesari furnizate prin metoda Lowry. După o dispariție de expunere de 45 de minute se măsoară la 750 nm în raport cu valoarea martor.
Pentru a stabili curba de calibrare (20 - 200) servește cazeină Gammmarstenu (vezi Ghidul pentru implementarea Biochimie UIRS pentru studenții speciali 1017 lucrare № 5 „Determinarea proteinelor din lapte prin metoda Lowry.“.). Se presupune că produsele de descompunere ale cazeinei dau aceeași dezagregare ca caseina nemodificată.
Experimentul se repetă de trei ori.
Calculul datelor obținute
Activitatea proteolitică pokazyvat câte mg proteină cazeină este transferată într-o formă solubilă de enzimă per miligram de droguri la 35? C, pH 6,6, pentru o anumită perioadă de timp. Calculul activității proteolitice (Ep) este realizată în conformitate cu următoarea formulă:
unde: Er - activitatea proteolitică a preparatului enzimatic;
C - concentrația preparatului enzimatic, mg;
A - cantitatea de produse de hidroliză cazeină solubilă în timp, mg
unde: B - cantitatea de produse de hidroliză cazeină, măsurată în extincția adecvat;
Volumul eșantionului (2 ml substrat, 0,5 ml de preparat enzimatic, 5 ml de soluție TCA) - 7,5;
V - numărul necesar pentru soluție colorimetric ml.
Materiale și reactivi. Casein (a se vedea apendicele 1, revendicarea 7.); Reactiv A, B, C (a se vedea apendicele 1, revendicarea 17); reactiv Folin (vezi anexa 1, revendicarea 8 ..); preparatele enzimatice; soluție TCA 1.125 M; 0.75M de sodiu soluție de hidroxid.
Echipamente. filtru cutată; tuburi; 1 pipetă și 2 ml dintr-o diviziune scală de 0,05 ml; 60 sau FEC-FEC-56m.