În prezent, există toate motivele să credem că în viitorul apropiat, domeniul de aplicare clinică a inductori de interferon va fi extins în mod semnificativ, iar aceste medicamente pot, cum ar fi interferon, utilizat in SARS, herpes, hepatita virală, infecția cu HIV, encefalita, rabie, și pentru a preveni complicații secundare virale care rezultă din aplicarea agenților citostatici și agenți imunosupresivi.
inductori de interferon aparțin unei noi generații de medicamente. Utilizarea acestor medicamente are mai multe avantaje față de interferoni recombinanți:
inductori de interferon nu au nici o antigenicitate.
Sinteza naturala (dar stimulat) de interferon endogen cauze giperinterferonemii, care apare adesea atunci când se utilizează interferonului recombinat și conduce la efecte secundare severe.
O singură administrare de inductori de interferon furnizează lung circulant interferon la un nivel terapeutic. Pentru a atinge acest nivel de interferoni exogeni necesită administrarea repetată a unor doze mari de interferoni recombinant. Unii inductori de interferon au o abilitate unica de a rula sinteza interferonului în anumite populații de celule care are avantaje semnificative față de stimularea policlonală a celulelor imune prin interferonului recombinat.
inductori de interferon au proprietăți imunomodulatoare și combinate nu numai cu interferoni recombinanți, dar, de asemenea, cu alte antivirale, cauzând astfel un efect sinergie al utilizării combinate.
medicamente utilizate în mod obișnuit sunt interferoni, recombinant α-interferon, care limitează foarte mult proprietățile lor antivirale, ca pentru apărare antivirale eficiente trebuie să aibă toate cele trei clase de interferoni, a căror sinteză și inductori de interferon de aplicare a invocat.
hormon de creștere (STH) - o proteina secretata de lobul anterior al glandei pituitare animalelor vertebrate. Prezența sa în extractele din glanda pituitară a fost observată în 1921. . Evans și J. lung, dar numai două decenii mai târziu, în 1944, a fost primită în formă de produs purificat, iar în 1948 - într-o formă cristalină.
Glanda pituitară umană conține de la 3,7 până la 6 mg de hormon de creștere, este reprezentat printr-un singur lanț polipeptidic de resturi de 191 aminoacizi
hormon de creștere uman este sintetizat în celulele bacteriene prin inginerie in mod specific, are avantaje evidente disponibile în cantități mari, preparatele sale sunt pure biochimică și lipsite de contaminare virală. biosintezei somatotropinele a fost efectuată cu angajații Geddelem Deoarece sinteza ADN-ului asupra hormonului mRNA urmată de transformarea acesteia într-o genă care codifică obținută formă dvuhnitievuyu precursorul somatotropină care este scindată în celulele bacteriene pentru a forma hormon activ, cercetătorii au ales următoarea abordare. În prima etapă dvuhnitievuyu donată copie ADN a ARNm și clivaj cu endonucleaze de restricție secvența primită care codifică întreaga secvență de aminoacizi a hormonului, cu exceptia primilor 23 de aminoacizi. Apoi clonat polinucleotide sintetice corespunzând aminoacizilor de la 1 minut la 23 minute și, în final, obținut două fragmente au fost combinate împreună, și „optimizat“ la o pereche de promotori și sit de legare ribozom. Randamentul final a fost de 2,4 g hormon de per 1 ml de cultură sau de 1% din proteina dizolvată din celulele dintr-o tulpină de inginerie genetica de E. coli.
Insulina (din țist pancreaticae Insulae - insulele pancreatice.) - hormonul belkovopeptidny, sintetizat în celulelor p ale insulelor pancreatice; un hormon anabolic universal, necesare pentru creșterea și dezvoltarea organismului, similar cu somatotropina hipofizare, sinergetic care, în acest sens este. Unul dintre efectele cele mai izbitoare ale insulinei este efectul hipoglicemiant.
Insulina - unul dintre hormonii pancreatici mai bine studiate. Efectul acestui hormon este legat de reglementarea de zahăr din sânge. Se crede că insulina îndeplinește o funcție auxiliară în transferul glucozei din sânge prin pereții vasului la țesuturile musculare unde se consuma glucoza în scopuri energetice, sau celule ale ficatului, în cazul în care glucoza este sintetizat polizaharida rezervă - glicogen. Aceasta sugerează că insulina favorizează eliminarea glucozei din sânge, ca urmare a orientării sale specifice pe suprafața membranei celulare, care facilitează penetrarea glucozei din prin aceasta sânge. Cu o lipsă de insulină în concentrația de glucoză din sânge începe să crească, după cum glucoza nu poate difuza liber in celule. În ultimul timp se consideră că insulina joacă un rol important în reglarea biosinteza glucozei în organism.
insulina structura Sendzherom a fost instalat. Această peptidă ciclică heterogen constând din două lanțuri legate prin două punți sulfura. Într-una dintre lanțurile, în plus, are o punte disulfidică internă. A lanțului 21 este conținut, și lanțul B - 30 resturi de aminoacizi.
De la primele experimente privind utilizarea insulinei pentru tratamentul diabetului zaharat, în 1922, acest hormon este eliberat din pancreas de animale (vaci și porci).
Există mai multe motive pentru dezvoltarea de metode adecvate pentru producția pe scară largă și introducerea pe piață a insulinei umane: printre ei considerente de ordin comercial și factori emoționali, precum și nevoile de dezvoltare a științei, precum și posibilele beneficii ale tratamentului.
Insulina ca vaci și porci este puțin diferită în secvența de aminoacizi de la insulina umană. Mai ales aproape umane și porcine insuline: în urmă numai treonina lanț B la C terminal este înlocuit cu alanină. bovine și insulină umană diferă cu trei resturi de aminoacizi și că aceste diferențe se determină creșterea activității insulină bovină imunogenă, comparativ cu insulina porcină. Aproape toți pacienții care sunt tratați cu metoda convențională, de exemplu, injectat cu insulină bovină în sânge de anticorpi par la insulină. Proprietățile antigenice ale insulinei sunt determinate parțial de impurități în formulările sale. Cel mai probabil, formarea de anticorpi la insulină explica unele ușoare reacții adverse atunci când injectii cu insulina de vaca, de exemplu, atrofia țesutului adipos subcutanat. În cazul insulinei porcine înalt purificată, aceste efecte sunt absente. Mai mult, anticorpi pentru a inactiva insulina in sange, astfel încât pacientul trebuie să injecteze doze mai mari decât este necesar. Anticorpii afectează, de asemenea, durata efectului biologic al insulinei injectat. Putem presupune că insulina umană va fi chiar mai puțin imunogen decât insulina porcină.
Deoarece numărul de pacienți cu diabet zaharat și, prin urmare, necesarul de insulină crește, este foarte posibil ca disponibilitatea în viitor, va scădea din cauza lipsei de materii prime - pancreas animal. Din cauza factorilor pur emoționale să utilizeze mai eficient insulina umană decât orice animal.
Mai mulți producători de insulină în frunte cu «Eli Lilly and Co» folosit ca bază pentru producerea de insulină umană a tehnologiei ADN-ului recombinant. Conform schemei de proces, a dezvoltat «Eli Lilly» in colaborare cu compania «Genenetech Inc.», în prima etapă pentru a recrea secvența ADN a secvenței de aminoacizi a insulinei, sintetizând separat genele artificiale lanțurile A și B. La capătul 5 „al fiecăruia dintre ele este un codon metionină (care în proteina sintetizată este N-terminal) și 3“ - secvențe de terminare. Fiecare dintre gene este apoi încorporată în gena β-galactozidaza plasmidelor și lor la rândul lor, introduse în celule de E. coli. Deoarece bacteriile sunt crescute pe mediu cu galactoză care este indusă în sinteza β-galactozidaza, și cu ea, lanțurile A și B ale insulinei atașat printr-un rest de metionină. După liza bacteriilor și tratarea cu bromură de cianogen, care scindează în mod specific proteinele la rest de metionină, lanțul B al insulinei sunt separate de β-galactozidază (metionină conține insulină). Apoi, purificarea se realizează lanțuri și combinarea acestora, prin care o insulină dublu catenar nativ. Sa demonstrat că nu conține proteine, endotoxine și E. coli pirogene, de proprietățile fizice nediferențiabile de insulina din pancreas uman și un sistem de testare prezintă activitate biologică deplină.
Ulterior, o metodă alternativă a fost testată: a fost sintetizat ca precursor al proinsulinei genei moleculei, care a fost introdus în Escherichia coli. După purificare, se proinsulinei de către tripsină și carboxipeptidază β asreceived si insulina nativă.
Insulina umană, produsă de E. coli, a fost prima „proteina de inginerie genetica“, testate la om. In experimentele cu voluntari sănătoși, sa constatat ca este sigur, în orice caz, atunci când se aplică scurt (nu provoacă reacții nedorite alergice sau alte) și are în mod substanțial aceeași capacitate de insulină porcină la scăderea nivelului de glucoză din sânge atunci când se administrează subcutanat și intravenos. În prezent, o mulțime de insulină umană sunt diabetici la nivel mondial. Acest lucru a fost precedat de studii clinice, pe parcursul căreia a studiat modificări în metabolismul și efectele imunologice. Astăzi este metoda uzuală de tratament.
Sarcina 2: Efectuarea lucrărilor de laborator.
Varianta 1. Hidroliza DNP drojdie și pentru detectarea componentelor din hidrolizatul NPD.
Progresul. Tubul lat condensator de aer cu o spatulă pentru a plasa drojdie uscată și se adaugă 10 ml soluție 10% acid sulfuric. Se introduce tubul într-o baie de apă care fierbe timp de 1 h. După ce sa răcit Hidrolizat și transporta cu el reacții calitative la componente ale PND.
reacția biuret la polipeptide. La 5 hidrolizatul turnat în picături, 10 picături de soluție de hidroxid de sodiu 10% și 2 picături de soluție de sulfat de cupru 1%. Observat aspectul de roz sau de culoare roz-violet.
test de argint pentru baze purinice. Pentru hidrolizatul s-a adăugat în picături 10 10 picături de soluție de amoniac până la o reacție alcalină, urmată de 20 de picături de soluție de azotat de argint amoniacal 2%. La picioare după 3 - 5 minute. format precipitat argint baze de culoare brun deschis săruri purinici.
reacție calitativă la pentoză (reacția Trommer). La 10 din hidrolizatul de test, în picături se adaugă 10 picături de soluție de hidroxid de sodiu 10% și 5 picături de soluție 7% de sulfat de cupru. Se încălzește ușor porțiunea superioară a tubului la fierbere și se fierbe timp de 1 minut. Există aspectul de o culoare roșie.
proba Molibdenul pe acid fosforic. La 10 picături 20 picături Hidrolizat turnat reactiv molibden și încălzit. Lichidul este vopsit în galben lamaie culoare. Tubul a fost răcit într-un curent de apă rece. Pe fundul tubului apare lamaie galben cristalin precipitat fosfornomolibdenovokislogo amoniu.
Opțiunea 2: Studiul dinamicii schimbării concentrației de zahăr din sânge de animale intacte (iepuri) la 30, 45, 60 min după administrarea hormonului isulina.
Insulina exercită o mare influență asupra metabolismului carbohidraților și, prin urmare, numit factor hipoglicemiant. Principalele celulele țintă ale insulinei sunt mușchi, ficat și țesutul adipos. Receptorii de insulină sunt localizate pe suprafața celulelor țintă și hormonul își exercită acțiunea sa nu pătrunde în celulă. Natura acțiunii insulinei asupra metabolismului glucidic este diversă. Aceasta crește permeabilitatea membranelor celulare pentru glucoză, aminoacizi și alți compuși. Insulina crește activitatea hexokinază, glicogen, oferind în același timp, efectul inhibitor asupra enzimelor de gluconeogeneză.
Semnificația practică. Insulina - un medicament care este administrat în scopuri terapeutice, în special în diabetul bolii. Se injectează numai parenteral, deoarece datorită naturii sale de proteine este inactivat în tractul gastrointestinal prin enzime proteolitice. Într-o persoană sănătoasă de după 20 - 30 min după administrarea insulinei la nivelul zahărului din sânge a scăzut la 50% din pornire, iar după 40 de minute, și începe să se ridice la 90 - 120 min ajunge normă sau chiar ușor deasupra.
De la ureche coajă de iepure pentru a lua 0,1 ml de sânge pentru a determina zahăr din sânge, înainte de injectarea de insulină.
Formularea de insulină inițială conținând 40 U / ml, diluat de 50 ori (0,2 ml insulină în ser fiziologic 9,8) și intră subcutanat iepure în suprafața laterală de 0,5 ml din diluția rezultată a insulinei, care este de 2 unități de insulină.
După 30, 45, 60 min după administrarea de insulină din vena auriculară iepure luată de fiecare dată de 0,1 ml de sânge pentru a determina nivelul de zahăr din sânge metoda orto-toluidină. Glucoza când este încălzit cu o-toluidină în soluție de acid acetic a dat culoare verde, a cărei intensitate este proporțională cu concentrația de glucoză:
D-glucoză + o-toluidină Produs de condensare verde.
probă de testare. Turnat într-un tub de centrifugă de 0,9 ml dintr-o soluție de acid tricloracetic 3% și să-l 0,1 ml de sânge. Se centrifughează timp de 10 min la 3000 rot / min. Supernatantul (centrifugat) este turnat într-un tub curat. Apoi, 0,5 ml de centrifugatului este introdus într-un tub de testare, se adaugă 2 ml reactiv de orto-toluidină închis cu un dop de sticlă și plasat într-o baie de apă la fierbere timp de 8 min, culoarea verde. Răcit sub jet de apa rece. Kolorimetriruyut pe photoelectrocolorimeter (filtru portocaliu sau roșu) în 5 mm cuvă împotriva apei.
O probă standard. O probă standard a fost preparat ca un proces, dar introduc 0,1 ml de soluție standard de glucoză (5,6 mmol / l) în loc de sânge, sub agitare, măsurată de 0,5 ml din această soluție într-un tub nou, se adaugă 2 ml de reactiv orto-toluidină, fiartă în apă baie, se răcește și apoi kolorimetriruyut.
în care cSt - concentrația de glucoză în soluție mmol / l standard, de 5,6 mmol / l;
Aprilie - probă test Extinction;
Masa - soluție standard de extincție.
2. Biotehnologie în 8 volume / Ed. Egorov NS Samuil VD - M. Vyssh.shk. - 1988.
Biotehnologie: obținerea de medicamente și de dezvoltare perspective / AI Tentsova, LM Bragintseva, TK Ustynyuk // Farmacie: revistă științifică. - M. Medicine. - 1988.
4. Biotehnologie: Principii și aplicații / Ed. Higgins I. Jones J. D. Cel mai bun -. Mir. - 1988.
7. Curs material în biotehnologie.
10. Sasson A. Biotehnologie: realizări și speranță / Trans. din limba engleză. Mehedova SL Mirkin, SM - Mir. - 1987.
11. Agricultura Biotehnologie: Textbook / Ed .. VS Shevelukha. - M. Executiv. săpt. - 1988. - 416 p.
producția biotehnologică de insulină recombinantă.
Crearea de proteine recombinante „a doua generație“, de exemplu insulină.
producția biotehnologic de interferon.
Probleme de standardizare a preparatelor de interferon.
Caracteristici de producție microbiologică a interleukine.
Perspectivele pentru producerea biotehnologică interleukinelor prin utilizarea tehnicilor de inginerie genetică.
Sinteza microbiologică a hormonului de creștere uman.
Probleme de proiectare producerea de hormon de creștere uman prin inginerie genetică.
9. producția biotehnologie industrială a factorilor de creștere peptidici