Izolarea ADN-ului folosind proteinaza K
Proteinaza K a fost dizolvat este liofilizat în apă distilată sterilă la o concentrație de 20 mg / ml, distribuită în alicoți și depozitate la -20 0C.
2.Nasyschenny tamponat fenol
In cele mai multe cazuri, de înaltă puritate fenol poate fi utilizată fără distilare suplimentară.
Fenolul se topește la 65 ° C, în prezența unui volum egal de 0,5 M Tris-HCI, pH 8,0, conținând 0,2% 8-hidroxichinolină și 0,2% 2-mercaptoetanol (2-ME). Când fenolul este complet topită, amestecul a fost bine agitat, faza apoasă a fost colectat și extras de două ori cu fenol, 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0, conținând 0,2% 2-ME. După faza apoasă nu este îndepărtată ultima extracție și se lasă într-un vas cu fenol. În această formă de fenol saturat poate fi depozitat la 4 ° C timp de 1 lună
3. Un amestec de cloroform: alcool izoamilic (24: 1, v / v)
4. tampon TE: 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0
1. Se prepară mostre.
2. Se adaugă la fiecare probă, 50 pl soluție proteinaza K (20 mg / ml) și se amestecă bine.
3.dobavlyayut pentru fiecare probă cu 250 soluție sarcozil fA se agita bine și cu atenție.
4. Probele se centrifughează la 3500 timp de 30 secunde.
probe de 5.Inkubiruyut la 50 0C timp de 5 h. Pentru comoditate, incubarea poate fi efectuată peste noapte (16 ore).
6.dobavlyayut la fiecare probă de 10 ml de fenol saturat cu tampon, se amestecă cu grijă, până când o emulsie omogenă.
7. Continuați extracția cu agitare la temperatura camerei timp de 5 minute.
8. Se centrifughează la 3500 timp de 1 minut.
9. Se adaugă 10 ml de cloroform: alcool izoamilic de extracție și a continuat timp de 5 minute.
10. Se separă fazele apoase și organice prin centrifugare la 3500, timp de 6 minute la temperatura camerei.
11. Se transferă faza apoasă vâscoasă la un tub nou folosind o pipetă alezaj larg, și se repetă extracția cu cloroform: alcool izoamilic o dată sau de două ori (până când interfaza este curat).
12.Dobavlyayut la faza apoasă, două volume de etanol, se amestecă bine și cu atenție. Precipitatul ADN-ul este format imediat după amestecare.
13. ADN Cobiralas precipitat prin centrifugare la 3500 timp de 5 minute.
14. Se extrage supernatantul și ADN-ul a fost spălat cu 20 ml de alcool de 70%.
15. Se spală ADN 1 ml de alcool de 70%, iar ADN-ul a fost transferat într-un tub de microcentrifugă.
ADN 16.Osazhdayut prin centrifugare la 3500 timp de 1 min și supernatantul a fost colectat.
17. ADN-ul este uscat sub vid, timp de 2,5 min.
18. ADN-ul este dizolvat în TE la o concentrație de aproximativ 1 mg / ml