Un grup mare de papillomavirusuri a devenit efectiv studiat recent. Stimul studiu intensiv al acestor virusuri este faptul că unele dintre ele sunt asociate cu apariția tumorilor maligne ale regiunii anogenitala. Dintre tumorile de localizare genitală ocupă un loc special al cancerului de col uterin, o etiologie virală este dovedită printr-o serie de studii epidemiologice și au confirmat prezența ADN-ului tumorii in tesutul anumitor tipuri de papilomavirus uman (HPV).
HPV - virusuri mici care conțin ADN, trăsătura caracteristică a, care este capacitatea de a induce proliferarea epiteliului pielii și / sau mucoaselor. HPV nu se multiplică în cultura de celule, astfel informații despre biologia virusurilor obținute cu ajutorul unor tehnici de genetica moleculara si studii epidemiologice. Existența 100 de tipuri, care diferă în structura ADN-ului, 75 dintre ele și complet donată molecular secvențat. tipizarea HPV nu se bazează pe diferențele antigenice și omologia ADN.
Printre 30 de tipuri de HPV care infectează regiunea anogenitală, distinge tipurile de înaltă și cu risc scăzut oncogen. HPV se gaseste in 93% din cazurile de cancer invaziv anogenitaly, cu 50% dintre ei - HPV16.
Instalat o transmitere sexuala mod de HPV. Datorită frecvente ședere HPV asimptomatică în corpul persoanelor infectate sunt de multe ori nu stiu ca sunt infectate. veruci genitale a aparut recent sunt mai contagioase decât lung stabilit.
Scăderea bruscă a imunității observate în SIDA, tratamentul cu medicamente citotoxice urmată de reactivarea pappllomavirusnoy infecții latente care se manifestă clinic ca multiple încolțirea formarea papillomatoznyh.
Cum este replicarea virusului, ansamblul de particule virale și eliberarea din celulă, nu poate fi considerată pe deplin stabilită încă. Există 2 moduri de replicare - replicare epizomală constantă a genomului în stratul epiteliului bazalyyum și replicare autonomă în celulele mai diferențiate ale stratului granular. replicarea epizomală a genomului are loc în mod continuu, dar numărul de copii de ADN este scăzut. replicare vegetativa are loc in nucleul celulei, unde progenituri generat HPV. Eliberarea de particule virale rezulta din degenerarea celulelor descuamate.
Deoarece studiul metodei HPV hibridizare extinde gama de virusuri oncogenice cu risc ridicat. Acest HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. Virusurile cu risc scăzut de tipuri de HPV oncogene sunt 56, 11, 42, 43, 44. HPV 16 mai adesea găsit în țesutul de scuamoase cancer de col uterin, HPV-18 - in cancerul de tesut glandular - adenocarcinom.
Tabel. 6.7 prezintă tipurile de HPV detectate în diferite pielea și mucoasele.
tipuri de HPV găsite în diferite leziuni ale pielii și mucoaselor
(Villiers EM 1989)
2, 6, 11, 16, 18, 30
Metode de aplicare de determinare a ADN-ului HPV crește eficiența detectării leziunilor precanceroase, în primul rând, deoarece sensibilitatea extrem de mare a metodelor, valoarea predictivă mai mare decât testul incomparabil citologică; În al doilea rând, standardizarea tehnicilor moleculare biologicheskph realizabile, în timp ce citologie cu dificultate poate fi redus la același standard.
Metode Neamplifikatsionnye în practica de diagnostic de rutină nu este utilizat în prezent, acestea sunt utilizate în scopuri de cercetare.
In tabl.6.8 ofera tehnici de biologie moleculară de bază utilizate pentru a determina ADN HPV.
Metode pentru detectarea ADN-ului HPV
Dot blot, hibridizarea Southern blot, hibridizare in situ
reacția de polimerizare în lanț - PCR
reacție în lanț Ligaznlya - RLC
Sistemul hibrid capcana - "Digenes Capture Hybrid System II"
metode de amplificare care au ca scop de a identifica oligonucleotide HPV tip specific în material și multiplicarea acestora număr utilizând amplificarea PCR sau RLC se numește țintă. Lumea utilizează mai mulți reactivi standard pentru toate tipurile de HPV, în țara noastră este utilizat practic preparat primeri de laborator.
Fără a intra în detalii cu privire la metodele amplificatoare țintă, se referă la metodele de amplificare a semnalului care nu necesită limitări în laborator, pentru laboratoarele de PCR specifice.
sistem trap dublu gene - „Capture Hybrid II“ Compania Abbott (SUA), este folosit fără acele restricții care sunt necesare atunci când se utilizează PCR. Acesta prevede:- interpretarea de calculator a rezultatelor, care elimină subiectivitatea în evaluare;
- repetabilitate și fiabilitatea rezultatelor;
- ciclu complet de cercetare într-o singură zi.
„Digene Hybrid Capture II“ sistem utilizează hibridizare ADN-ARN în soluție urmată de reacția „coadă“ între proba de ARN immunologncheskoy hibridomului - ADN țintă și anticorpi specifici acestui hibrid. Testul datorează specificitate mare la mai multe componente independente.
În primul rând, obiectivul este intregul genomul HPV. ARN simplu spiralat lung hibridizează în mod eficient cu toate 8000 nucleotide ADN HPV. hibrid ARN-ADN este mai stabilă, evitând astfel reacțiile secundare nedorite.
În al doilea rând, sursa de sensibilitate de reacție suplimentară este de a utiliza anticorpi la hibridul ARN-ADN, cu o multitudine de molecule conjugate ale fosfatazei alcaline. Acești anticorpi marcați recunosc un hibrid mod ARN-ADN lanturi scurte, care nu are legătură cu secvențele de nucleotide ale ADN-ului și ARN-ului. Mii de molecule de anticorp poate acoperi unitate genomic hibrid ADN HPV.
În al treilea rând, fiecare fosfatază alcalină enzimă imobilizată reacționează cu o varietate de molecule hemilyuminestsenta 1 minut și compusului dioxetan determină un flux constant de fotoni, care sunt numărate luminometru tub fotomultipleyernoy.
În al patrulea rând, un sistem capcana gena are un avantaj asupra amplificării naturale, implică o cantitate mare (10-20%), materialul clinic în reacție.
Capcana folosește o sondă de ARN hibrid complementară secvenței genomice complete și 13 tipuri de HPV cu risc cancerigen 5 oncogen scăzut. Compilat „cocktail-uri“ de risc ridicat și scăzut, respectiv. Fiecare „cocktail“ incubat separat cu ADN denaturat (mono-catenar) din material clinic. Formată hibrid ARN-ADN este transferat în godeurile panourilor micro pe care sunt imobilizați anticorpi monoclonali la hibrid ADN-ARN. Anticorpii recunosc în mod specific hibrid, care este atașat la panoul de bine. Cei prinse prin aceasta hibrizi ADN-ARN sunt apoi reacționat cu un anticorp monoclonal față de hibridul marcat cu fosfatază alcalină sau mișcări la fiecare godeu. Excesul de anticorpi și molecule nehibridizate se îndepărtează prin spălare. Alveolele sunt adăugate compusului dioxetan substrat luminescent. Dacă substratul este distrus de fosfatază alcalină, este emisia luminii. Emisia de lumină poate fi măsurată cu ajutorul unui luminometru. Cantitatea de lumină generată proporțional cu numărul de ADN țintă în eșantion.
Sensibilitate Sistem analitic - 0,2 pg / ml (1000 copii HPV genomului).
Detectarea HPV folosind „Digenes Hybrid Capture II“ este un adjuvant eficient pentru citologie de col uterin si poate ajuta la reducerea incidenței și mortalității din cauza cancerului de col uterin.